Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用技术

本发明专利技术提供了Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用，对菌液进行均质和超声的前处理后，先利用阳离子交换层析进行粗纯，然后采用疏水层析进一步纯化，纯化后的产物再进行Protein A亲和层析，即得纯化后的Peptibody多表位疫苗的终产物。所述的分离纯化方法简单稳定，可有效、快速地处理大量样品，各纯化环节有机配合，纯化效率得到显著提高，操作简单，易于放大生产。通过所述的分离纯化方法，产物纯度达86％以上，Peptibody多表位疫苗的免疫原性好，能够有效引起机体产生特异性免疫应答，实现了抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的规模纯化，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用
本专利技术属于基因工程重组蛋白纯化
，涉及Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用，特别涉及一种抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用。
技术介绍
在bFGF和VEGF等细胞因子的共同作用下，不断生成的肿瘤血管能够为肿瘤细胞的发展提供氧气和营养物质，因此，bFGF和VEGF已经成为有效抑制肿瘤血管新生和肿瘤细胞发展的靶点分子。专利技术人团队前期成功构建含有三个bFGF、三个VEGF抗原优势表位和人IgG1Fc片段基因(Peptibody多表位疫苗)的pET28a质粒以及重组大肠杆菌Peptibody工程菌(BL21)，并成功建立了Peptibody工程菌的发酵生产工艺。在前述研究中，对Peptibody多表位疫苗也进行了纯化，但在将该纯化方法用于规模化纯化时，研究发现仍需至少对如下技术难点进行突破解决：(1)菌体单次处理量较小。(2)超声破碎无法实现大量菌体的快速破碎，难以获得适于进行蛋白纯化的样品。(3)ProteinA亲和层析是根据ProteinA与IgGFc具有极高亲和力的特点，对抗体和含IgGFc的重组蛋白进行分离的纯化方法，特异性高，能够简单方便地获得高纯度蛋白。虽然Peptibody多表位疫苗含有Fc片段，可通过ProteinA纯化蛋白，但工艺放大后大肠杆菌破碎上清存在大量菌体蛋白，严重影响Peptibody多表位疫苗与ProteinA柱的结合；另外，ProteinA填料价格十分昂贵，原有纯化方法成本高，难以实现规模化生产；同时，Peptibody多表位疫苗的最终设计是人用制剂(例如注射剂)，虽然诸如镍亲和层析等金属螯合填料的蛋白捕获量大，但是残留的镍离子对人体有潜在危害。(4)规模化纯化中各纯化环节的配合有待进一步改善。(5)纯化工艺效率及对纯化过程中目的蛋白的稳定性有待进一步提高。因此，本专利技术对研究实践中所发现的技术问题开展了进一步的深入研究，以期实现Peptibody多表位疫苗规模化的分离纯化。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术纯化Peptibody多表位疫苗的缺点与不足，基于申请人的研究成果，本专利技术对Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法进行了进一步的创新研究与完善，对纯化方法工艺进行了放大和改进，提供了一种抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法；该分离纯化方法基于阳离子交换层析、疏水层析和ProteinA亲和层析技术，能够实现规模纯化抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗。本专利技术的另一目的在于提供所述的Peptibody多表位疫苗分离纯化方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，包括如下步骤：(1)将Peptibody多表位疫苗发酵产物均质至澄清，以破碎大肠杆菌的细胞壁；然后将均质液超声破碎至不粘稠，以破碎大肠杆菌的DNA，得到破碎上清液；(2)将步骤(1)的破碎上清进行阳离子交换层析，收集洗脱液Ⅰ，初步纯化Peptibody多表位疫苗；(3)将步骤(2)的洗脱液Ⅰ进行疏水层析，收集洗脱液Ⅱ，进一步纯化Peptibody多表位疫苗；(4)将步骤(3)的洗脱液Ⅱ进行ProteinA亲和层析，得到所述的Peptibody多表位疫苗纯化产物，即本专利技术的终产物。本专利技术所述的Peptibody多表位疫苗为申请人设计的新型疫苗，已在中国专利申请CN201711202680.5中记载，该疫苗是由具有免疫原性的三个bFGF表位肽和三个VEGF表位肽，通过柔性Linker(GGGS)串联成多表位肽，并与IgG1的Fc片段偶连，其氨基酸序列如中国专利申请CN201711202680.5中的SEQIDNO.1所示。所述的Peptibody多表位疫苗纯化产物优选在缓冲液中保存；所述的缓冲液优选为0.015MPBS(pH＝7.4)。所述的分离纯化方法还可以包括浓缩步骤和/或替换缓冲液的步骤；所述的浓缩和/或缓冲液替换步骤优选为超滤，具有浓缩时间短，样品处理量大，蛋白损失量小，操作方便等优势，可快速实现目的蛋白的浓缩和缓冲体系的置换；所述的缓冲液优选为0.015MPBS(pH＝7.4)。步骤(1)中所述的均质的单次破碎菌体可达400g，菌液体积为800mL，工作压力优选为900bar，均质循环次数优选为7个循环，使菌体均质完全，若循环次数过多，会对目的蛋白造成额外的损伤。步骤(1)中所述的超声优选使用1/2破头进行超声；进一步优选超声破碎条件如下：冰浴，1/2破头，频率30％，工作5s、停5s，有效破碎时间30min；工作5s、停5s能够兼顾快速有效破碎、目的蛋白保持稳定和仪器寿命等环节。步骤(1)中所述的破碎上清液优选过膜后再进行步骤(2)的操作；所述的膜的孔径优选为0.22μm。步骤(2)中所述的阳离子交换层析的填料优选为CaptoTMSImpAct，所述填料不仅具有高分辨率和高物理化学稳定性(pH稳定性和耐压)的优点，还具备高载量和高流速等优势，且价格较低，具有良好的重复性和工艺放大能力。步骤(2)中所述的阳离子交换层析以PB-NaCl为洗脱体系，按照20mM的PB：1MNaCl(V:V)＝50:50、30:70、0:100进行梯度洗脱，收集30:70、0:100峰值洗脱液；洗脱流速优选为25mL/min；其中，PB表示磷酸缓冲液。第一个梯度洗脱大部分杂蛋白，后两个梯度收集目的蛋白和部分杂蛋白。步骤(2)所述的阳离子交换层析的具体方法为：a.CaptoTMSImpAct阳离子交换填料装入XK50/30层析柱，用1MNaCl(AKTAPrimePlus纯化仪的B泵)清洗柱子，流速＝25mL/min，时间＝40min；b.用20mMPB(纯化仪的A泵)平衡柱子至UV基线稳定，流速＝25mL/min；c.将步骤(1)所得的破碎上清液加入平衡后的层析柱，洗去柱子中未结合的蛋白，清洗至UV回到基线，流速＝25mL/min；d.采用20mM的PB：1MNaCl(V:V)＝50:50、30:70、0:100进行梯度洗脱，洗脱流速＝25mL/min，收集30:70、0:100峰值洗脱液。步骤(3)中所述的疏水层析的填料优选为PhenylSepharoseHP。步骤(3)中所述的疏水层析的洗脱体系为按20mMPB：NaCl(V:V)＝25:75、50:50、75:25、100:0和水进行梯度洗脱，收集各峰值洗脱液；所述的NaCl的浓度优选为2～3M，进一步优选为2M，与3MNaCl相比，2MNaCl的盐浓度依然可以很好地维持目的蛋白与疏水填料的结合，结合盐浓度的降低可以降低目的蛋白的洗脱梯度和减少洗脱时间，提升洗脱效率；洗脱流速优选为8mL/min。步骤(3)中所述的疏水层析的具体操作方法为：a.Pheny本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)将Peptibody多表位疫苗发酵产物均质至澄清，然后将均质液超声破碎至不粘稠，得到破碎上清液；/n(2)将步骤(1)的破碎上清进行阳离子交换层析，收集洗脱液Ⅰ；/n(3)将步骤(2)的洗脱液Ⅰ进行疏水层析，收集洗脱液Ⅱ；/n(4)将步骤(3)的洗脱液Ⅱ进行Protein A亲和层析，得到所述的Peptibody多表位疫苗纯化产物，即为本专利技术的终产物；/n所述的Peptibody多表位疫苗为申请号为CN201711202680.5的中国专利申请所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗，其氨基酸序列如中国专利申请CN201711202680.5中的SEQID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将Peptibody多表位疫苗发酵产物均质至澄清，然后将均质液超声破碎至不粘稠，得到破碎上清液；
(2)将步骤(1)的破碎上清进行阳离子交换层析，收集洗脱液Ⅰ；
(3)将步骤(2)的洗脱液Ⅰ进行疏水层析，收集洗脱液Ⅱ；
(4)将步骤(3)的洗脱液Ⅱ进行ProteinA亲和层析，得到所述的Peptibody多表位疫苗纯化产物，即为本发明的终产物；
所述的Peptibody多表位疫苗为申请号为CN201711202680.5的中国专利申请所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗，其氨基酸序列如中国专利申请CN201711202680.5中的SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的超声使用1/2破头进行超声；
步骤(1)中所述的破碎上清液过膜后再进行步骤(2)的操作；
所述的分离纯化方法还包括浓缩步骤和/或替换缓冲液的步骤。


3.根据权利要求2所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的均质的单次破碎菌体为400g，菌液体积为800mL，工作压力为900bar，均质循环次数为7次；
步骤(1)中所述的超声的破碎条件为：冰浴，1/2破头，频率30％，工作5s、停5s，有效破碎时间30min；
所述的膜的孔径为0.22μm；
所述的浓缩和/或缓冲液替换步骤为超滤；
所述的缓冲液为0.015MPBS。


4.根据权利要求1所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的阳离子交换层析的填料为CaptoTMSImpAct；
步骤(2)中所述的阳离子交换层析以PB-NaCl为洗脱体系，按照20mM的PB：1MNaCl(V:V)＝50:50、30:70、0:100进行梯度洗脱，收集30:70、0:100峰值洗脱液；洗脱流速为25mL/min；其中，所述的PB指磷酸缓冲液。


5.根据权利要求1所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的疏水层析的填料为PhenylSepharoseHP；
步骤(3)中所述的疏水层析的洗脱体系为按20mMPB：NaCl(V:V)＝25:75、50:50、75:25、100:0和水进行梯度洗脱，收集各峰值洗脱液；洗脱流速为8mL/min；其中，所述的PB指磷酸缓冲液。


6.根据权利要求1或5所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的ProteinA亲和层析的预装柱为HiTraprProteinAFF；
步骤(4)中所述的ProteinA...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓宁，张利刚，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44