一种蛋白质表达纯化的方法技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质表达纯化的方法，首先构建融合蛋白的表达载体：在目的蛋白的一端依次连接第一酶切位点、报告标记和第一纯化标签，另一端依次连接第二酶切位点、第二纯化标签；将该表达载体转入表达菌株进行表达培养，收集培养产物；根据第二纯化标签对产物进行纯化，然后对第一、第二酶切位点进行酶切；将酶切产物分别根据第一纯化标签、第二纯化标签进行纯化，即得到目标蛋白。该表达纯化方法增加了蛋白质的可溶性和产量，使得蛋白质的表达可视化；纯化步骤简单，在未增加纯化的流程的情况下，显著提高了目的蛋白的纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质表达纯化的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种蛋白质表达纯化的方法。
技术介绍
表达外源蛋白的一般策略是将目的基因连接到合适的载体上，然后将载体转入表达菌株中表达目的蛋白，最后将表达菌株进行破碎，富集、纯化需要的目的蛋白。该过程需要解决目的蛋白的表达和纯化两个问题：目的基因在表达菌株中表达足够量的蛋白质；2、选择合适的手段对目的蛋白进行纯化。此外，充足的表达量也有利于蛋白质的纯化。为了后续纯化的方便，技术人员常常利用6×His、MBP等标签来通过亲和层析纯化目的蛋白。但是这些标签往往带来新的问题，如6×His标签由于其特异性不好，往往带来纯化效率低的问题；而MBP-tag过于庞大，可能会影响蛋白的结构功能。除此之外，如何鉴定目的基因是否在表达菌株中表达也是一个问题。通常的手段是将表达菌株破碎后用合适的磁珠吸附、富集之后再通过SDS-PAGE胶来判定目的基因是否表达，而一个表达载体的构建往往不是一蹴而就的，需要不断地优化，这就造成了很多时间的浪费以及试剂的损失。为了解决这个问题，有技术人员提出在目的基因的末端连接一个gfp基因，使目的基因和gfp融合表达，当表达菌株在培养过程中带有绿色荧光时，就可以确定目的基因已经表达。专利文献CN110628801A提供了一种将gfp基因插入目的基因末端融合表达的方法，包括构建目的基因-gfp-his表达载体，然后利用gfp基因表达的GFP蛋白发出荧光来判断目的蛋白是否表达；利用Ni离子亲和层析柱纯化的方法来纯化目的蛋白。然而，由于Ni离子亲和层析柱的非特异性吸附，在亲和层析处理之后往往有较多的杂蛋白，想要得到更高纯度的蛋白需要更加繁琐的纯化手段，如分子筛等其它手段，而且对于6×His-tag并未进行切除。专利文献CN103819563A和CN108508210A分别提供了一种MBP-tag和目的蛋白融合表达然后纯化的方法，引入MBP-tag显著提高了融合蛋白溶解性，但是在检测目的蛋白是否表达时仍然需要通过收集大肠杆菌菌液，破碎富集之后用MBP-beads吸附，进行SDS-PAFE胶来判断，增加了很多繁琐的流程。综上，本领域技术人员希望开发一种新的蛋白质表达纯化方法，既可以直观判断目的蛋白的表达情况，又可以对目的蛋白进行高效、高纯度的纯化和富集。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种蛋白质表达纯化的方法，该方法促进了目的蛋白的可溶性表达，通过该方法可直观判断目的蛋白的表达情况，并且对目的蛋白进行高效、高纯度的纯化和富集。为此，本专利技术的第一方面提供一种用于表达纯化目的蛋白的融合蛋白，包括：目的蛋白，于所述目的蛋白的一端依次连接的第一酶切位点、报告标记和第一纯化标签，于所述目的蛋白的另一端依次连接的第二酶切位点、第二纯化标签；其中，所述目的蛋白中不含有所述第一酶切位点或第二酶切位点。正如本领域技术人员所知晓的，蛋白质具有氨基端(N端)和羧基端(C端)。当所述目的蛋白的一端为N端时，所述目的蛋白的另一端为C端；当所述目的蛋白的一端为C端时，所述目的蛋白的另一端为N端。进一步，所述第一酶切位点与第二酶切位点相同，所述第一酶切位点和第二酶切位点选自凝血酶(Thrombin)酶切位点、HRV3C(humanrhinovirus3C)酶切位点、TEV(tobaccoetchvirus)酶切位点、肠激酶(enterokinase)酶切位点、SUMO蛋白酶(SUMOProtease)酶切位点中的一种。进一步，所述第一纯化标签选自组氨酸标签(His-tag)、Flag标签(Flag-tag)、HA标签(HA-tag)、SUMO标签(SUMO-tag)中的一种。进一步，所述第二纯化标签具有提高所述融合蛋白的表达量和/或可溶性的功能。进一步，所述第二纯化标签选自麦芽糖结合蛋白标签(MBP-tag)、谷胱甘肽巯基转移酶标签(GST-tag)中的一种或两种连接而成的融合标签。进一步，所述报告标记选自氯霉素-乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷转移酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、荧光蛋白中的一种。进一步，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、mCherry、mTAGBFP2、mCLOVER3、EGFP、Venus、mTagBFP2、mIFP和TagRFP657中的一种。在具体实施方式中，所述目的蛋白为2019-nCov核衣壳蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，其N端依次连接HRV3C酶切位点、MBP-tag，其C端依次连接HRV3C酶切位点、GFP和His-tag；所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：8。本专利技术的第二方面，提供编码所述融合蛋白的基因。在具体实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：8，编码所述融合蛋白的基因的核苷酸序列为SEQIDNO：7。本专利技术的第三方面，提供含有所述基因的表达载体或表达盒。本专利技术的第四方面，提供一种蛋白质的表达纯化方法，包括：S1、构建表达所述融合蛋白的表达载体，将所述表达载体转入表达菌株；在适于表达所述融合蛋白的条件下培养所述表达菌株，收集培养得到菌体进行细胞破碎，得到粗产物I；S2、将所述粗产物I通过可特异性分选所述第二纯化标签的方式进行纯化，得到粗产物II；S3、向所述粗产物II加入特异性识别并切割第一酶切位点和第二酶切位点的酶，进行酶切反应，得到粗产物III；S4、将所述粗产物III分别通过可特异性分选所述第二纯化标签的方式、和可特异性分选所述第一纯化标签的方式进行纯化，得到目标蛋白。进一步，所述表达载体的构建步骤包括：对编码目的蛋白的核苷酸序列做密码子优化，使其适于在所述表达菌株中表达。密码子优化可采用本领域的通常策略，例如根据表达菌株的密码子偏好性进行优化、根据预测mRNA二级结构进行优化、根据GC含量或热稳定性进行优化等。所述表达载体为适于转化至所述表达菌株，并且在转化至表达菌株后可在一定条件下表达所述融合蛋白的分子或实体，例如核酸、质粒、噬菌体或病毒；优选为质粒。除非本专利技术另有说明，构建所述表达载体的具体步骤不应成为限制本专利技术的条件，所述表达载体的构建可采用本领域的通常方法，例如酶切连接、Gibsonassembly、GoldenGate等。进一步，所述表达菌株为原核表达菌株或真核表达菌株。进一步，所述表达菌株选自大肠杆菌、毕赤酵母菌、酿酒母菌或裂殖酵母菌；优选为大肠杆菌。进一步，当纯化标签为His-tag时，可特异性分选His-tag的方式为Ni离子亲和层析柱洗脱；当纯化标签为Flag-tag时，可特异性分选Flag-tag的方式为抗Flag亲和柱洗脱；当纯化标签为HA-tag时，可特异性分选HA-tag的方式为Anti-HA免疫磁珠亲和柱洗脱；当纯化标签为SUMO-tag与Hist-ag联用时，可特异性分选所述标签的方式为Ni离子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于表达纯化目的蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：目的蛋白，于所述目的蛋白的一端依次连接的第一酶切位点、报告标记和第一纯化标签，于所述目的蛋白的另一端依次连接的第二酶切位点、第二纯化标签；/n其中，所述目的蛋白中不含有所述第一酶切位点或第二酶切位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于表达纯化目的蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：目的蛋白，于所述目的蛋白的一端依次连接的第一酶切位点、报告标记和第一纯化标签，于所述目的蛋白的另一端依次连接的第二酶切位点、第二纯化标签；
其中，所述目的蛋白中不含有所述第一酶切位点或第二酶切位点。


2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一酶切位点与第二酶切位点相同，所述第一酶切位点和第二酶切位点选自凝血酶酶切位点、HRV3C酶切位点、TEV酶切位点、肠激酶酶切位点、SUMO蛋白酶酶切位点中的一种。


3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一纯化标签选自组氨酸标签、Flag标签、HA标签、SUMO标签中的一种。


4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二纯化标签具有提高所述融合蛋白的表达量和/或可溶性的功能；和/或，
所述第二纯化标签选自麦芽糖结合蛋白标签、谷胱甘肽巯基转移酶标签中的一种或两种连接而成的融合标签。


5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述报告标记选自氯霉素-乙酰转移酶、β-半乳糖苷转移酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和荧光蛋白中的一种；
优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、mCherry、mTAGBFP2、mCLOVER3、EGFP、Venus、mTagBFP2、mIFP和TagRFP657中的一种。


6.编码权利要求1-5任一项所述融合蛋白的基因。


7.含有权利要求6所述基因的表达载体或表达盒。
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈郑，郑兰花，洪礼清，蒋奎胜，刘仁源，
申请(专利权)人：东莞市东阳光诊断产品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44