一种具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽制造技术

本发明专利技术公开了一种具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽。本发明专利技术所述的抗肿瘤多肽p46(人源p53蛋白的361‑382片段)的羧基端通过连接肽与RGDR序列(精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸‑精氨酸)连接，通过固相合成法制备得到p46‑RGDR。动物体内抗肿瘤实验证明，本发明专利技术的多肽具有较强的抗肿瘤作用，能够有效抑制乳腺癌和肺癌的肿瘤增长。小动物活体成像实验证明，本发明专利技术的肿瘤靶向性多肽与p46原型肽相比，能够显著的富集到肿瘤组织部位，具有靶向治疗的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽
本专利技术涉及生物工程制药
，具体涉及一种具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽。
技术介绍
p53是由人类TP53基因编码的分子量为43.7KDa的蛋白质。p53蛋白作为一种转录因子，通过序列特异性方式结合其靶基因的启动子从而调节靶基因的表达，由此激活多种细胞内生物学效应。在细胞应激情况下，DNA发生损伤，p53蛋白通过磷酸化、甲基化和乙酰化等方式活化，活化后的p53稳定于细胞核内，调节参与细胞周期停滞、细胞凋亡、DNA修复等基因的表达，对于肿瘤抑制具有重要意义。TP53是所有癌症类型中突变最频繁的基因，TP53突变与癌症的发生、发展和转移密切相关，并且导致肿瘤细胞对放、化疗等癌症疗法产生抵抗以及不良预后。G.Selivanova等研究表明来源于p53C-端结构域的合成多肽p46(peptide46,GSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKK)可以恢复突变型p53蛋白的肿瘤生长抑制功能，从而选择性的杀伤肿瘤细胞。p46，即人源p53蛋白的361-382片段，是一种富含赖氨酸的22肽，相应于p53的单链DNA末端结合位点。在体外，p46能活化野生型p53的DNA结合作用，并且可以恢复活细胞内一些突变型p53蛋白的转录反式激活功能，诱导表达p53的肿瘤细胞发生凋亡。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与αv整合素及NRP-1特异性结合的具有肿瘤靶向性和细胞穿透性的抗肿瘤多肽。本专利技术采取的技术方案如下：本专利技术将活性蛋白和RGDR在C-端进行连接，构建一种具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽p46-RGDR，具体为活性蛋白通过连接肽与RGDR(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸)连接；所述的活性蛋白为p46或与p46具有85％-99％同一性且具抗肿瘤活性的多肽。在一些实施例中，所述的活性蛋白为p46或与p46具有90％-99％同一性且具抗肿瘤活性的多肽；在一些更具体的实施例中，所述的活性蛋白为p46或与p46具有95％-99％或者具体为具有99％同一性且具抗肿瘤活性的多肽。在一些实施例中，本专利技术所述的连接肽为1～50个富含Gly和/或Ala和/或Ser氨基酸残基的柔性肽；在一些具体的实施例中，所述的连接肽为1～10个富含Gly和/或Ala和/或Ser氨基酸残基的柔性肽；在一些更具体的实施例中，所述的连接肽为1～10个富含Gly氨基酸残基的柔性肽。在一种具体的实施例中，本专利技术所述抗肿瘤多肽p46-RGDR氨基酸序列如SEQIDNo:1所示，或与SEQIDNo:1所示氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；或者与SEQIDNo:1所示氨基酸序列具有90％-99％同一性的多肽；或者与SEQIDNo:1所示氨基酸序列具有95％-99％或者更具体的具有99％同一性的多肽。本专利技术的肿瘤靶向多肽p46-RGDR，p46的羧基端通过连接肽与RGDR序列相连，可以通过常规的固相合成法进行合成，当其具体为SEQIDNo:1所示的多肽时，分子量为3145.45道尔顿。本专利技术还提供一种药物组合物，包含本专利技术所述的抗肿瘤多肽p46-RGDR和药学上可接受的载体。本专利技术还提供所述的抗肿瘤多肽p46-RGDR或药物组合物在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。本专利技术所述的肿瘤是高表达整合素受体αvβ3、αvβ5和/或神经纤毛蛋白受体的实体瘤，在一些实施例中，包括但不限于乳腺癌、肺癌等。本专利技术的有益效果是：1.动物体内抗肿瘤实验证明，本专利技术的多肽具有较强的抗肿瘤作用；2.小动物活体成像实验证明，本专利技术的肿瘤靶向性多肽与p46原型肽相比，能够显著的富集到肿瘤组织部位，具有靶向治疗的作用。附图说明图1为p46原型肽、本专利技术多肽体内抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的生长。图2为p46-3、本专利技术多肽体内抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的生长。图3为p46原型肽、本专利技术多肽体内抑制LLC小鼠肺癌细胞的生长。图4为荧光肽的体内分布情况。图5为本专利技术多肽的纯度测定。图6为本专利技术多肽的分子量测定。图7为p46原型肽的纯度测定。图8为p46原型肽的分子量测定。图9为多肽p46-3的纯度测定。图10为多肽p46-3的分子量测定。图11为FITC-p46原型肽的纯度测定。图12为FITC-p46原型肽的分子量测定。图13为FITC-p46-RGDR的纯度测定。图14为FITC-p46-RGDR的分子量测定。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。为了比较本专利技术多肽的实际效果，本专利技术同时合成了p46原型肽，其氨基酸序列如SEQIDNo:2所示；也合成了多肽p46-3作为对比，其氨基酸序列如SEQIDNo:3所示，p46-3含有p46原型肽的全部氨基酸序列，且在其C-端含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列。实施例1本专利技术多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo:1所示，其合成方法为固相合成法，以wang树脂为载体，采用Fmoc保护策略，20％哌啶的DMF溶液为脱保护试剂，HOBT/HBTU/DIEA为缩合体系，进行偶联反应，重复脱保护、洗涤、偶联、洗涤、脱保护等常规操作，直至所有的氨基酸依次全部偶联成功。选择TFA/苯酚/苯甲硫醚/乙二硫醇/水作为切割试剂，将多肽从树脂上切割下来。合成的多肽粗品经反相高效液相色谱分离纯化，如图5所示，目标肽段的纯度可达97％；对纯化产物进行质谱表征，如图6所示，ESI-MS鉴定结果与目标多肽的理论相对分子量一致，表示成功合成本专利技术多肽。采用同样的方法，合成SEQIDNo:2所示的p46原型肽和SEQIDNo:3所示的多肽p46-3。p46原型肽的纯度鉴定结果如图7所示，质谱鉴定结果如图8所示。多肽p46-3的纯度鉴定结果如图9所示，质谱鉴定结果如图10所示。此外，采用同样的方法，合成了5-异硫氰酸荧光素标记的多肽：FITC-p46和FITC-p46-RGDR。FITC-p46原型肽的纯度鉴定结果如图11所示，质谱鉴定结果如图12所示。FITC-p46-RGDR的纯度鉴定结果如图13所示，质谱鉴定结果如图14所示。实施例21.动物体内抗肿瘤实验137℃水浴条件下快速复苏小鼠乳腺癌4T1细胞，然后转移至含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，置于细胞培养箱中于37℃，5％CO2条件下进行培养。待细胞生长至对数期时，进行传代，获得足够的细胞数量；培养的4T1细胞经胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，PBS清洗三次，用无血清培养基重悬细胞，在显微镜下进行计数，稀释成1×106个/ml细胞悬液。以0.1ml接种于4-5周龄Balb/c小鼠左前肢腋下。待肿瘤平均体积达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽p46-RGDR，其特征在于活性蛋白通过连接肽与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸连接；所述的活性蛋白为p46或与p46具有85％-99％同一性且具抗肿瘤活性的多肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽p46-RGDR，其特征在于活性蛋白通过连接肽与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸连接；所述的活性蛋白为p46或与p46具有85％-99％同一性且具抗肿瘤活性的多肽。


2.根据权利要求1所述的具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽p46-RGDR，其特征在于，所述的活性蛋白为p46或与p46具有90％-99％同一性且具抗肿瘤活性的多肽。


3.根据权利要求2所述的具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽p46-RGDR，其特征在于，所述的活性蛋白为p46或与p46具有95％-99％或者具体为具有99％同一性且具抗肿瘤活性的多肽。


4.根据权利要求1所述的具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽p46-RGDR，其特征在于，所述连接肽为1～50个富含Gly和/或Ala和/或Ser氨基酸残基的柔性肽；优选的，所述的连接肽为1～10个富含Gly和/或Ala和/或Ser氨基酸残基的柔性肽；更优选的，所述的连接肽为1～10个富含Gly氨基酸残基的柔性肽。


5.根据权利要求1所述的具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽p46-RGDR，其特征在于，所述抗肿瘤多肽p46-R...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳兴珍，许曹莹，杨佳慧，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32