包含与LAG3结合的抗原结合位点的双特异性抗体制造技术

本发明专利技术涉及特别适用于癌症治疗的新型抗体。根据本发明专利技术的所述抗体是双特异性或多特异性抗体，并且包含与LAG3结合的第一抗原结合位点。所述第一抗原结合位点是自主VH结构域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含与LAG3结合的抗原结合位点的双特异性抗体
本专利技术涉及工程化的免疫球蛋白结构域，更具体地涉及具有改善的稳定性的工程化的免疫球蛋白重链可变结构域，以及此类免疫球蛋白结构域的文库。本专利技术进一步涉及用于制备此类免疫球蛋白结构域的方法，以及使用这些免疫球蛋白结构域的方法。本专利技术进一步涉及包含与LAG3结合的抗原结合位点的双特异性或多特异性抗体，编码此类抗体的多核苷酸，以及产生此类抗体的方法。
技术介绍
单结构域抗体片段可来源于骆驼科物种的天然存在的重链IgG(称为VHH)或软骨鲨(cartilagousshark)的IgNAR(称为VNAR)。尽管单结构域抗体具有使其成为临床开发所感兴趣的候选物的几种特性，但是非人单结构域抗体由于其在人体中的免疫原性而不适用于治疗应用。然而，来源于常规人IgG的单结构域抗体片段由于其低稳定性和溶解性而易于聚集(Ward等人，Nature341,544-546(1989))，这限制了它们在蛋白质稳定性至关重要的治疗中的应用。不稳定的蛋白质倾向于部分展开并聚集，这最终导致治疗功效降低且出现不期望的副作用。已经采取了几种改善单结构域和其他重组抗体片段的稳定性/溶解性的方法。基于选择的方法涉及抗体的文库选择，例如在高温、极端pH或者在蛋白酶或变性剂的存在下进行选择。基于工程化的方法包括将二硫键和其他稳定化突变引入抗体中。一种获得具有改善的稳定性的单结构域抗体的方法是从包含大量单结构域抗体种类的文库中进行选择。为了产生此类文库，将一种单结构域抗体用作支架，该单结构域抗体可以经工程化以具有改善的稳定性。然后可以通过常规淘选从文库中选择具有所需靶结合特异性的子代单结构域抗体，因为所述子代单结构域抗体将在很大程度上继承亲本支架的改善的特性。另一种获得具有改善的稳定性的单结构域抗体的方法是将稳定化突变(诸如表面暴露的亲水或荷电氨基酸)引入先前选择的具有所需结合特性的单结构域抗体中。将人工二硫键引入蛋白质中已被认为是一种增加蛋白质构象稳定性的策略。然而，不适当位置的二硫键代替非但不能增强蛋白质的稳定性，反而可能对折叠蛋白质中的周围氨基酸具有不利影响，或干扰现有的有利相互作用。尽管为二硫键交联选择合适的位置是至关重要的，但尚无为此确立的规则。已经提出了将通过引入人工非规范二硫键来工程化单结构域抗体作为改善单结构域抗体的稳定性的策略。重链可变(VH)结构域自然地包含半胱氨酸残基23与104(IMGT编号，对应于根据Kabat编号系统的残基22和92)之间的高度保守的二硫键，该高度保守的二硫键连接VH的核心中的两条β链B和F，并且对其稳定性和功能至关重要。经证明，将54位与78位(IMGT编号，对应于根据Kabat编号系统的49位和69位)之间的第二非天然二硫键引入骆驼科VHH(Saerens等人，JMolBiol377,478-488(2008)；Chan等人，Biochemistry47,11041-11045(2008)；Hussack等人，PlosOne6,e28218(2011))或人VH(Kim等人，ProtEngDesSel25,581-589(2012)；WO2012/100343)中导致了它们的热稳定性和(在VHH的情况下)蛋白酶抗性增大(Hussack等人，PlosOne6,e28218(2011))。此特定的二硫键已经在先前被鉴定为天然存在于独特的单峰骆驼VHH中(Saerens等人，JBiolChem279,51965-51972(2004))。它连接VHH疏水核心中的框架区2(FR2)和框架区3(FR3)。尽管原则上有效，但是此方法并非没有缺点，起缺点包括降低的亲和力、特异性和表达产量(Hussack等人，PlosOne6,e28218(2011))。因此，仍然需要稳定的单结构域抗体。免疫系统在预防癌症方面的重要性是基于其检测和破坏异常细胞的能力。然而，一些肿瘤细胞能够通过引起免疫抑制状态来逃避免疫系统(Zitvogel等人，NatureReviewsImmunology6(2006),715-727)。T细胞在抗病毒和抗肿瘤免疫应答中具有重要作用。抗原特异性T细胞的适当活化导致其克隆扩增并获得效应子功能，并且在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的情况下，这使CTL能够特异性地裂解靶细胞。T细胞一直是治疗上操纵内源性抗肿瘤免疫力的主要焦点，这是由于T细胞的选择性识别所有细胞区室中的蛋白质衍生肽的能力；直接识别和杀伤抗原表达细胞的能力(通过CD8+效应T细胞；也被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL))和协调各种免疫应答的能力(通过CD4+辅助T细胞)，这整合了适应性和先天性效应机制。T细胞功能障碍由于持续的抗原暴露而发生：T细胞丧失了在抗原存在下进行增殖的能力，并且逐渐不能产生细胞因子及裂解靶细胞。功能障碍的T细胞被称为耗竭的T细胞，其不能增殖并发挥效应子功能(诸如细胞毒性和响应于抗原刺激而进行细胞因子分泌)。进一步研究发现，耗竭的T细胞的特征为抑制性分子PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)的持续表达，而阻断PD-1和PD-L1(PD-1配体)相互作用可以逆转T细胞耗竭并在感染LCMV的小鼠中恢复抗原特异性T细胞应答(Barber等人，Nature439(2006),682-687)。然而，仅靶向PD-1–PD-L1途径并不总是导致T细胞耗竭的逆转(Gehring等人，Gastroenterology137(2009),682–690)，这表明其他分子可能参与T细胞耗竭(Sakuishi，J.ExperimentalMed.207(2010),2187-2194)。最初是在设计用于选择性分离在IL-2依赖性NK细胞系中表达的分子的实验中发现了淋巴细胞活化基因-3(LAG3或CD223)(TriebelF等人，CancerLett.235(2006),147–153).LAG3是一种独特的跨膜蛋白，其与具有四个细胞外免疫球蛋白超家族样结构域(D1-D4)的CD4具有结构同源性。膜远端IgG结构域含有短氨基酸序列，即在其他IgG超家族蛋白中未发现的所谓额外环。细胞内结构域含有独特的氨基酸序列(KIEELE,SEQIDNO:75)，该氨基酸序列是LAG3对T细胞功能产生负面影响所必需的。LAG3可以由金属蛋白酶在连接肽(CP)处裂解，以产生在血清中可检测到的可溶形式。与CD4一样，LAG3蛋白与MHCⅡ类分子结合，但是具有更高的亲和力并且在与CD4不同的位点处(Huard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997),5744-5749)。LAG3由T细胞、B细胞、NK细胞和浆细胞样树突细胞(pDC)表达，并且在T细胞活化后上调。它调节T细胞功能以及T细胞稳态。免疫无能的或功能受损的常规T细胞的亚群表达LAG3。LAG3+T细胞在肿瘤部位和慢性病毒感染期间富集(Sierro等人，ExpertOpin.Ther.Targets15(2011),91-101)。已有研究表明，LAG3在CD8T细胞耗竭中起作用(Blackburn等人，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双特异性或多特异性抗体，其包含与LAG3结合的第一抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点是自主VH结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180131 EP 18154312.51.一种双特异性或多特异性抗体，其包含与LAG3结合的第一抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点是自主VH结构域。


2.根据权利要求1所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述双特异性或多特异性抗体包含与PD1结合的第二抗原结合位点。


3.根据权利要求1或2所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，根据Kabat编号，所述自主VH结构域在(i)52a位和71位或(ii)33位和52位中包含半胱氨酸，其中所述半胱氨酸在合适的条件下形成二硫键。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，与LAG3结合的所述自主VH结构域包含
(i)具有SEQIDNO:146所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:147所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:148所示的序列的CDR3；或者
(ii)具有SEQIDNO:149所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:150所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:151所示的序列的CDR3；或者
(iii)具有SEQIDNO:152所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:153所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:154所示的序列的CDR3；或者
(iv)具有SEQIDNO:155所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:156所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:157所示的序列的CDR3；或者
(v)具有SEQIDNO:158所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:159所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:160所示的序列的CDR3；或者
(vi)具有SEQIDNO:161所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:162所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:163所示的序列的CDR3；或者
(vii)具有SEQIDNO:164所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:165所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:166所示的序列的CDR3；或者
(viii)具有SEQIDNO:167所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:168所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:169所示的序列的CDR3；或者
(ix)具有SEQIDNO:170所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:171所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:172所示的序列的CDR3；或者
(x)具有SEQIDNO:173所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:174所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:175所示的序列的CDR3；或者
(xi)具有SEQIDNO:176所示的序列的CDR1、具有SEQIDNO:177所示的序列的CDR2和具有SEQIDNO:178所示的序列的CDR3。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述自主VH结构域包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述自主VH结构域还包含选自由以下项组成的组的取代：H35G、Q39R、L45E和W47L。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述自主VH结构域还包含选自由以下项组成的列表的取代：L45T、K94S和L108T。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述自主VH结构域包含VH3_23人框架，特别是基于即曲妥珠单抗的VH框架。


9.根据权利要求2至8中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述与PD1结合的第二抗原结合位点包含
VH结构域，所述VH结构域包含
(i)CDR-H1，其包含SEQIDNO:201所示的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其包含SEQIDNO:202所示的氨基酸序列，以及
(iii)CDR-H3，其包含SEQIDNO:203所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，所述VL结构域包含
(i)CDR-L1，其包含SEQIDNO:204所示的氨基酸序列；
(ii)CDR-L2，其包含SEQIDNO:205所示的氨基酸序列，以及
(iii)CDR-L3，其包含SEQIDNO:206所示的氨基酸序列。


10.根据权利要求2至9中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述与PD1结合的第二抗原结合位点包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域包含SEQIDNO:192所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQIDNO:193所示的氨基酸序列。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述双特异性或多特异性抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。


12.根据权利要求2至11中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述双特异性或多特异性抗体包含Fc结构域和Fab片段，所述Fab片段包含所述与PD1结合的第二抗原结合位点。


13.根据权利要求12所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述Fc结构域是IgG，特别是IgG1Fc结构域或IgG4Fc结构域。


14.根据权利要求12或13所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，特别是与Fcγ受体的结合。


15.根据权利要求12至14中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述Fc结构域是人IgG1亚类，具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G，编号依据为根据Kabat的EU索引。


16.根据权利要求12至15中任一项所述的双特异性或多特异性抗体，其特征在于，所述Fc结构域包含促进所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·科达里·迪克，S·登格尔，J·菲舍尔，T·霍费，L·拉里维雷，E·默斯纳，S·泽贝尔，P·乌玛纳，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH