一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区编码基因序列依次如SEQ ID NO.1‑3所示，且轻链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4‑6所示，所述重链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区编码基因序列依次如SEQ ID NO.7‑9，重链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10‑12所示，本发明专利技术涉及基因工程方面单克隆抗体的制备技术领域。该重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，该重组单抗结构明确、特异性强、稳定性更好，在多种检测方法中表现出高灵敏度，适合体外诊断试剂中的应用，批间差异小，抗体效价高，单位生产成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程方面单克隆抗体的制备
，具体为一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用。
技术介绍
抗体是生命科学领域最重要的科研工具之一，传统的抗体生产是通过免疫动物获得单克隆或多克隆抗体，如抗人血幼素(HJV)抗体的生产，多克隆抗体是通过向动物体内注射人血幼素(HJV)蛋白作为免疫原，获取免疫后的血清制得，理论上，只要该动物不死亡，抗体可以持续获取，单克隆抗体是用人血幼素(HJV)蛋白免疫宿主动物后，提取能识别该免疫原的B细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，经过筛选培育出能永久增殖产生抗体的杂交瘤细胞。与之对比的是，重组抗体的生产只需要前期免疫动物，或者甚至不需要免疫动物，仅通过一定的途径获取到抗人血幼素(HJV)抗体的序列(可进行杂交瘤细胞中目的基因的钓取或者人为设定基因序列，后期再通过检测手段验证表达的蛋白是否识别目标蛋白)，再将目标序列插入到克隆载体中，进行大量扩增后，转入真核或原核细胞中培养表达，产生抗体，因为该抗体基因明确，即使细胞中途死亡，也可以通过重新转入基因序列，再次获得性能稳定的重组抗体。因此，基于以上原理和生产工艺的不同，重组抗人血幼素(HJV)抗体相较于传统方式获取的抗体，在特异性、敏感性、批间差异性方面优势明显，这在很大程度上提高了科研实验的成功率，且重复性好，总言之，极大的节省了科研项目的人力、物力。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，该重组单抗结构明确、特异性强、稳定性更好，在多种检测方法中表现出高灵敏度，适合体外诊断试剂中的应用。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区编码基因序列依次如SEQIDNO.1-3所示，且轻链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQIDNO.4-6所示，所述重链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述重链可变区编码基因序列依次如SEQIDNO.7-9，且重链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQIDNO.10-12所示。本专利技术还公开了一种含有如权利要求1所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3编码基因的表达载体。本专利技术还公开了一种含有如权利要求1所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3编码基因的表达载体。本专利技术还公开了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：S1、用人血幼素抗原免疫小鼠，获得小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与SP20细胞进行融合制得杂交瘤细胞，提取总RNA，逆转录获得cDNA；S2、以cDNA为模板，进行引物设计，扩增出对应抗体的重链可变区和轻链可变区的编码基因；S3、将重链可变区编码基因转入含有重链恒定区基因的表达载体中，将轻链可变区编码基因转入含有轻链恒定区基因的表达载体中，完成质粒重组，重组后的质粒转入感受态细胞中，进行PCR扩增鉴定，然后安排测序；S4、将鉴定及测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒，将携带重链和轻链基因的质粒共转染到哺乳动物细胞，收集所培养的细胞上清进行蛋白纯化，得到的即为重组小鼠抗人血幼素抗体。优选的，所述步骤S2中以cDNA为模板，小鼠内参基因GAPDH为引物进行PCR扩增，扩增出长度为320bp的目的条带，则说明逆转录cDNA能够用于后续实验。优选的，所述步骤S3中重组小鼠抗人血幼素抗体可变区扩增中引物设计的具体步骤为：通过多序列比对及简并引物设计，在前导肽和可变区的相对恒定区设计可扩增重组小鼠抗人血幼素抗体的可变区基因的引物。优选的，所述步骤S3中重组小鼠抗人血幼素抗体可变区扩增中序列扩增的具体步骤为：通过以cDNA为模板，聚合酶链式反应扩增出可变区基因，然后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。本专利技术还公开了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体在体外诊断试剂中的应用。(三)有益效果本专利技术提供了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用。与现有技术相比具备以下有益效果：(1)、该重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区编码基因序列依次如SEQIDNO.1-3所示，且轻链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQIDNO.4-6所示，重链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区编码基因序列依次如SEQIDNO.7-9，且重链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQIDNO.10-12所示，本专利技术抗体蛋白质和基因结构明确，稳定性好，即使表达该抗体的细胞株不存在了，也可以重新制备能够表达该抗体的新细胞株，批间差异小，抗体效价高，抗体产量高，单位生产成本低。(2)、该重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，对人血幼素(HJV)抗原表位的识别率高，特异性好，对于组织中天然抗原和重组抗原均能够很好的识别。附图说明图1为本专利技术为小鼠脾脏细胞和SP20融合的杂交瘤细胞总RNA电泳示意图；图2为本专利技术为小鼠脾脏细胞和SP20融合的杂交瘤细胞cDNA内参扩增电泳示意图；图3为本专利技术轻链可变区扩增琼脂糖凝胶电泳示意图；图4为本专利技术重链可变区扩增琼脂糖凝胶电泳示意图；图5为本专利技术可变区基因片段的纯化琼脂糖凝胶电泳示意图；图6为本专利技术纯化后的抗体SDS-PAGE电泳分析结果示意图；图7为本专利技术小鼠抗人血幼素抗体活性检测结果示意图；图8为本专利技术小鼠抗人血幼素抗体ELISA效价测定曲线拟合结果示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1-8，本专利技术实施例提供一种技术方案：一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，其生物材料来源：小鼠脾脏细胞(武汉百杰康生物科技有限公司)、SP2/0(武汉百杰康生物科技有限公司)、小鼠重链恒定区载体pBE27(武汉百杰康生物科技有限公司)、载体pET28a(+)(湖南丰晖生物科技有限公司)、小鼠轻链恒定区载体pBE28(武汉百杰康生物科技有限公司)，其他生物材料和试剂均为可直接购买的商品。一.重组小鼠抗人白介素19(IL19)抗体可变区基因的钓取1.杂交瘤细胞的RNA提取及逆转录得到cDNA先通过人血幼素(HJV)抗原免疫小鼠，获得小鼠脾脏细胞，小鼠脾脏细胞与SP20融合获得杂交瘤细胞，Triz1法提取杂交瘤细胞RNA，经琼脂糖凝胶电泳可见清晰的28和18S条带本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体，其特征在于：包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区编码基因序列依次如SEQ ID NO.1-3所示，且轻链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4-6所示，所述重链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述重链可变区编码基因序列依次如SEQ IDNO.7-9，且重链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10-12所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体，其特征在于：包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区编码基因序列依次如SEQIDNO.1-3所示，且轻链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQIDNO.4-6所示，所述重链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述重链可变区编码基因序列依次如SEQIDNO.7-9，且重链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQIDNO.10-12所示。


2.一种含有如权利要求1所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3编码基因的表达载体。


3.一种含有如权利要求1所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3编码基因的表达载体。


4.一种如权利要求1所述的重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、用人血幼素抗原免疫小鼠，获得小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与SP20细胞进行融合制得杂交瘤细胞，提取总RNA，逆转录获得cDNA；
S2、以cDNA为模板，进行引物设计，扩增出对应抗体的重链可变区和轻链可变区的编码基因；
S3、将重链可变区编码基因转入含有重链恒定区基因的表达载体中，将轻链可变区编码基因转入含有轻链恒定区基因的表达载体中，完成质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩陈，王文杰，程强，
申请(专利权)人：武汉百杰康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42