经修饰的活猪流感病毒疫苗的检测制造技术

本发明专利技术分别涉及用于检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的诊断试剂盒及方法以及用于区分接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物的诊断试剂盒及方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的活猪流感病毒疫苗的检测本申请包含根据37C.F.R.1.821–1.825的序列表。该申请附带的序列表以引用的方式完整地并入本文中。专利技术背景在1918年首次报道了猪的流感感染，并且在1930年将第一猪流感病毒从猪分离(Shope，R.E.，1931，J.Exp.Med.54:373-385)。猪流感(SI)是由A型及C型流感病毒引起的猪的急性呼吸道疾病。其严重程度取决于许多因素，包括宿主年龄、病毒株以及继发性感染(Easterday,1980,PhilosTransRSocLondBBiolSci288:433-7)。在1998年之前，在美国主要是将“典型”H1N1SI病毒(SIV)从猪分离(Kida等人，1994，JGenVirol75:2183-8；Scholtissek，1994，EurJEpidemiol10:455-8；Olsen等人，2000，ArchVirol.145:1399-419)。在1998年，在美国的多个州中将H3N2亚型SIV分离出来。SIV复制局限于猪的上呼吸道及下呼吸道的上皮细胞、鼻粘膜、筛骨、扁桃体、气管以及肺，并且病毒分泌及传播仅通过呼吸途径发生。因此可将传染性病毒从所提到的组织以及从扁桃体、支气管肺泡灌洗(BAL)流体以及鼻、扁桃体或口咽拭子分离(KristienVanReeth以及WenjunMa，2013，CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology370:173–200)。流感病毒粒体由包含单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋状的核壳体)以及内部衬有基质蛋白(M1)的外部脂蛋白包膜组成。流感A病毒的节段基因组由编码十一种多肽的八条线性负极性单链RNA分子组成，这些多肽包括：形成核壳体的依赖于RNA的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1以及PA)以及核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2)；从含有脂质的包膜突出的两种表面糖蛋白：血凝素(HA)以及神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)、核输出蛋白(NEP)；以及促凋亡因子PB1-F2。A型流感病毒分为17种HA(血凝素)以及10种NA(神经氨酸酶)亚型，其可以产生许多可能的组合(命名为H1N1、H1N2、H2N1、H2N2、H5N1、H5N2等等)(Tong等人，2012，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，109:4269-4274)。血凝素(HA)在使病毒依附到受感染细胞的表面方面发挥作用，而神经氨酸酶(NA)在使子代病毒从受感染细胞解脱出来方面发挥作用，因此NA在病毒的传播方面发挥作用(Wang等人，2009，Biochem.Biophys.Res.Commun.，386:432-436)。疫苗接种是管理畜群健康的基本工具。生产者非常希望使用依从性标记来确定动物是否已适当地接种。WO2009/058835A1描述了几乎不可能区分由接种产生的抗体与响应于自然感染而形成的抗体。进一步，WO2009/058835A1描述了例如纯化木聚糖酶的使用，其作为依从性标记添加到猪流感疫苗，并且描述了在血清中的特异于木聚糖酶的抗体的检测。NS1的修饰可以用于产生减毒活SIV，如Solórzano等人2005(JVirol79:7535–7543)、Vincent等人2012(JournalofVirology19:10597至10605)WO2006/083286A2以及WO2016/137929A1所述。已经利用反求遗传学产生了表达具有73、99或126个氨基酸(Tx/98NS1D73、Tx/98NS1D99以及Tx/98NS1D126)的H3N2SIV(sw/Texas/4199-2/98、Tx/98)的NS1截短蛋白的减毒SIV。WO2006/083286A2描述了经修饰的活猪流感疫苗，但仅描述了用于确认NS节段的截短的RT(逆转录酶)-PCR实验。进一步，Pica等人2012(JournalofVirology86:10293–10301)使用SYBRqPCR技术来评估在小鼠的肺中疫苗抑制传染性野生型病毒复制的程度。然而，所有文件均未公开一种用于确定动物的适当接种的方法或一种允许在感染了SIV的动物与接种了经修饰的活猪流感特异性疫苗的动物之间进行区分的方法。进一步，所有文件均未公开针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针。因此，需要用于确定动物的适当接种的方法并且需要允许在感染了SIV的动物与接种了经修饰的活猪流感特异性疫苗的动物之间进行区分的方法。专利技术简述在描述本专利技术的各方面之前，须注意，如本文中所用以及在随附权利要求中，单数形式“一个”、“一种”以及“该”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“一种抗原”的引用包括多种抗原，对“病毒”的引用是对一个或多个病毒及本领域的技术人员已知的其等同物的引用，以此类推。除非另有限定，否则本文中所用的所有技术及科学术语均具有如本专利技术所属
的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所描述的类似或等同的任何方法及材料都可在本专利技术的实践或测试中使用，但现在描述优选的方法、装置及材料。本文所提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以用于描述并公开出版物中所报道的可与本专利技术结合使用的细胞系、载体及方法。本文中的任何内容都不应被解释为承认本专利技术无权先于根据先前专利技术的这些公开。本专利技术解决现有技术中固有的问题并在现有技术中提供明显改进。总的来说，本专利技术提供一种用于检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的诊断试剂盒，其包括针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包括SEQIDNO:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(SEQIDNO:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。有利地，本专利技术所提供的实验数据揭露了本专利技术的寡核苷酸探针可以检测各种稀释度的不同样品中的猪流感病毒特异性疫苗。术语“诊断试剂盒”是指用于检测或测量所述经修饰的活猪流感特异性疫苗的试剂盒。如本文中所用的术语“试剂盒”是指在别处提到的组件、尤其是针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的集合。试剂盒还可以包括针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针、如在本文其他地方所描述的引物、缓冲液、说明书等等。所述组件可以或可以不包装在一起。试剂盒的组件可以由单独的小瓶构成(即，作为单独部件的试剂盒)或设置在单一小瓶中。此外，应理解，本专利技术的试剂盒是用于实践本文所提及的方法。优选地，设想以随时可用的方式提供所有组件以实践本文所提及的方法。进一步，试剂盒优选地包含用于执行所述方法的说明书。说明书可以通过呈纸或电子形式的用户手册来提供。例如，手册可以包括用于解释当使用本专利技术的试剂盒执行前述方法时所获得的结果的说明书。术语“动物”是指动物，优选指哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、荷兰猪(guineapig)、兔、仓鼠、猪、羊、狗、猫、马、猴子或牛，并且还优选指人。更优选地，受试者为猪。优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的诊断试剂盒，其包括针对所述经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括SEQ ID NO:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(SEQ ID NO:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171220 EP 17208943.51.一种用于检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的诊断试剂盒，其包括针对所述经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括SEQIDNO:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(SEQIDNO:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。


2.一种用于区分接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物的诊断试剂盒，其包括：
a.针对所述经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括SEQIDNO:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(SEQIDNO:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；
b.针对所述猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针，其用于检测猪流感病毒感染。


3.一种用于在生物样品中检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：
a.获得含有来自动物的至少一种核酸的生物样品；
b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对所述经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括SEQIDNO:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(SEQIDNO:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；
c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对与所述生物样品接触；
d.使用针对所述经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及
e.检测所述信号，其中检测出所述信号指示在所述生物样品中接种了猪流感病毒特异性疫苗。


4.一种区分接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物的方法，其包括：
a.获得含有来自动物的至少一种核酸的生物样品；
b.提供
i)至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对，以及
ii)用于检测猪流感病毒特异性疫苗接种的针对所述经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括SEQIDNO:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(SEQIDNO:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸，以及提供
iii)用于检测猪流感病毒感染的针对所述猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针；
c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对与所述生物样品接触；
d.使用针对所述经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针及/或针对所述猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及
e.检测所述信号，其中
i)使用针对所述经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针检测出信号指示所述生物样品中接种了猪流感特异性疫苗，并且
ii)使用针对所述猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针检测出信号指示所述生物样品中感染了猪流感病毒。


5.一种用于在动物组内检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：
a.获得含有来自动物的至少一种核酸的环境样品；
b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对所述经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括SEQIDNO:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(SEQIDNO:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；
c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；
d.使用针对所述经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及
e.检测所述寡核苷酸探针信号，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·莫劳布拉泽耶夫斯卡，K·D·杜利特尔，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE