检测HBV基因型和/或X区突变的方法、试剂盒，HBx的CDS标准序列、引物及应用技术

本发明专利技术公开了一种检测HBV基因型和/或X区突变的方法、试剂盒，HBx的CDS标准序列、引物及应用。选取测序序列中间HBx的CDS与10种HBx的CDS标准序列进行同源性分析及比对，得出待检HBV基因型和/或X区突变的结果；进一步还能通过测序峰图中套峰情况判断单一基因型与混合基因型，若无套峰或数目小于10个，则判定为单一基因型；若套峰数目≥10个，则判定为混合基因型。本发明专利技术提供了一套便捷、准确性高的同时检测10种HBV基因型及X区突变类型检测的方案，可以为HBV感染者疾病进展风险评估、抗病毒人群的筛选、抗病毒方式选择及疗效预测提供参考依据。

【技术实现步骤摘要】
检测HBV基因型和/或X区突变的方法、试剂盒，HBx的CDS标准序列、引物及应用
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种PCR定向测序结合标准序列比对检测10种HBV基因型及X区突变的方法、试剂盒，HBx的CDS标准序列、引物及应用。
技术介绍
中国是全球范围内肝癌发病率和死亡率最高的国家，据估计，中国的肝癌死亡人数约占全球肝癌死亡人数的一半。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)持续感染是我国肝癌发生的最主要的原因，约76％的肝癌发生与之相关(deMartelC,Maucort-BoulchD,PlummerM,etal.World-widerelativecontributionofhepatitisBandCvirusesinhepatocellularcarcinoma.Hepatology,2015,62(4):1190-1200)。目前认为，HBVDNA和HBsAg的水平是慢性乙型肝炎预后的关键的影响因素，但是HBV基因型以及HBV基因组突变与慢性乙型肝炎的进展及预后密切相关。低HBVDNA和HBsAg水平的患者进展为肝硬化/肝癌的风险最低，而高HBVDNA和HBsAg水平同时合并特定基因型HBV感染以及HBV基因组突变的风险最高(Chen,C.J.,etal.,RiskofhepatocellularcarcinomaacrossabiologicalgradientofserumhepatitisBvirusDNAlevel.Jama,2006.295(1):p.65-73.；Yang,H.I.,etal.,AssociationsbetweenhepatitisBvirusgenotypeandmutantsandtheriskofhepatocellularcarcinoma.JNatlCancerInst,2008.100(16):p.1134-43.)。基于HBV全基因组序列的差异，目前已鉴定出10种基因型(A-J，序列差异超过7.5％)。不同基因型HBV在地理分布、传播途径、疾病转归以及对现有治疗反应情况等方面存在显著差异。欧美国家主要流行的是A和D型，我国最主要流行的是B和C型，并且南方以B型流行为主，北方以C型流行为主。A和D型主要通过人群之间水平传播；相比于感染D型，感染A型采用IFN-α治疗的效果更好，但进展为肝硬化和肝癌的比例都更高。B和C型主要通过母婴垂直传播，相比于感染C型，感染B型的患者IFN-α治疗的效果更好，且进展为肝硬化和肝癌的比例更低(RajoriyaN,CombetC,ZoulimF,etal.HowviralgeneticvariantsandgenotypesinfluencediseaseandtreatmentoutcomeofchronichepatitisB.Timeforanindividualisedapproach？.JHepatol,2017,67(6):1281-1297)。HBVX区基因突变检测及意义：HBV基因组全长3200bp左右，由完全或部分重叠的P、S、X和C区构成，其中典型的X区为1374-1838的区域，为HBxCDS，编码全长154个氨基酸的HBx蛋白。并且X区包含了HBV的增强子II(EnhancerII，1636-1744)和基本核心启动子(basalcorepromoter，BCP，1751-1769)的元件，已有大量研究表明该区域特定位点的突变与乙肝的病情进展及不良预后密切相关。例如：位于X区的基因突变中G1613A、C1653T、T1753V、A1762T、G1764A、3’末端片段缺失突变均会显著增加肝细胞癌发生的风险，其中A1762T/G1764A双位点同时突变是HBV相关肝癌发生的独立危险因子；而T1753V,A1762T,G1764A,C1766T,T1768A会显著增加慢加急性肝衰竭发生的风险(LinCL,KaoJH.NaturalhistoryofacuteandchronichepatitisB:TheroleofHBVgenotypesandmutants.BestPractResClinGastroenterol,2017,31(3):249-255)。目前对HBV基因分型的原理均基于不同基因型HBV在特定的区域存在序列上的差异，分型方法主要包括限制性片段长度多态性分析、型特异性探针法检测、基因芯片法分析以及基因测序法鉴定等。限制性片段长度多态性因为检测效能不高，现已很少使用。目前使用较多的分型方法是型特异性探针法和基因芯片法，型特异探针法灵敏度高，操作较复杂，每种基因型需要设计对应的特异性探针，检测成本不低；基因芯片法使用的芯片制作繁琐、检测成本高。且分型特异性探针法和基因芯片法均不能获得HBV的序列信息，因而无法获得突变的信息。基因测序法主要有全基因测序和S基因测序等。全基因测序是HBV基因分型的“金标准”，分型的准确度最高，并且能够获得完整的突变位点信息，但耗时费力且成本高昂；S基因测序分型能够获得部分序列信息，分型准确性高，但是无法获得包含较多已知致病突变的X区的序列信息。目前尚无利用X区测序进行分型并同时检测HBV的X区突变的方法和试剂的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种准确、快速、简便、经济的检测HBV所有10种已知基因型并同时检测X区突变的方法。该方法主要基于病毒X区的全长序列来检测HBV的基因型以及X区的突变。检测HBV基因型和/或X区突变的方法，包括以下步骤：(1)利用针对HBV的X区两端保守区域设计能扩增10种基因型HBV病毒基因组X区的通用引物进行PCR定向扩增，然后测序；(2)选取测序序列中间HBx的CDS与10种HBx的CDS标准序列进行同源性分析及比对，得出待检HBV基因型和/或X区突变的结果；HBV-A型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.13所示；HBV-B型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.14所示；HBV-C型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.15所示；HBV-D型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.16所示；HBV-E型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.17所示；HBV-F型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.18所示；HBV-G型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.19所示；HBV-H型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.20所示；HBV-I型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.21所示；HBV-J型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.22所示。本专利技术基于GenBank数据库中已知基因型的HBV全基因组序列分析和统计，分别获得了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测HBV基因型和/或X区突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)利用针对HBV的X区两端保守区域设计能扩增10种基因型HBV病毒基因组X区的通用引物进行PCR定向扩增，然后测序；/n(2)选取测序序列中间HBx的CDS与10种HBx的CDS标准序列进行同源性分析及比对，得出待检HBV基因型和/或X区突变的结果；/nHBV-A型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.13所示；/nHBV-B型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.14所示；/nHBV-C型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.15所示；/nHBV-D型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.16所示；/nHBV-E型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.17所示；/nHBV-F型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.18所示；/nHBV-G型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.19所示；/nHBV-H型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.20所示；/nHBV-I型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.21所示；/nHBV-J型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQ ID NO.22所示。/n...

【技术特征摘要】
1.检测HBV基因型和/或X区突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用针对HBV的X区两端保守区域设计能扩增10种基因型HBV病毒基因组X区的通用引物进行PCR定向扩增，然后测序；
(2)选取测序序列中间HBx的CDS与10种HBx的CDS标准序列进行同源性分析及比对，得出待检HBV基因型和/或X区突变的结果；
HBV-A型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.13所示；
HBV-B型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.14所示；
HBV-C型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.15所示；
HBV-D型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.16所示；
HBV-E型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.17所示；
HBV-F型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.18所示；
HBV-G型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.19所示；
HBV-H型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.20所示；
HBV-I型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.21所示；
HBV-J型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.22所示。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，能扩增10种基因型HBV病毒基因组X区的上游引物兼测序引物X1序列如SEQIDNO.1所示；能扩增10种基因型HBV基因组X区的下游引物X2序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，引物扩增的片段长度618bp，包含完整的HBxCDS。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，选取测序序列中间HBx的CDS与10种HBx的CDS标准序列进行同源性分析及比对，测序序列与哪种HBx的CDS标准序列同源性最高即判定为哪一种基因型，得出待检HBV基因型和/或X区突变的结果；进一步还能通过测序峰图中套峰情况判断单一基因型与混合基因型，若无套峰或数目小于10个，则判定为单一基因型；若套峰数目≥10个，则判定为混合基因型。


5.检测HBV基因型和/或X区突变的试剂盒，其特征在于，包括：
针对HBV的X区两端保守区域设计的能扩增10种基因型HBV病毒基因组X区的通用引物和10种HBx的CDS标准序列，具体如下：
HBV-A型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.13所示；
HBV-B型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.14所示；
HBV-C型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SEQIDNO.15所示；
HBV-D型标准全基因组序列对应的HBx的CDS标准序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：周艳文，许振宇，刘其摇，龚国忠，蒋永芳，周宁，肖新强，马静，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43