一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及生物技术及医学检验技术领域，为解决传统病毒核酸检测方法准确度低、特异性差，灵敏度低的问题，提供了一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物、试剂盒及方法，所述新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物，包括：第一引物探针组，包括正向引物ORF1ab‑F，探针ORF1ab‑P和反向引物ORF1ab‑R；第二引物探针组，包括正向引物N‑F，探针N‑P和反向引物N‑R；第三引物探针组，包括正向引物Rpp30‑F，探针Rpp30‑P和反向引物Rpp30‑R。本发明专利技术的引物探针组合物通过扩增引物对及检测探针的巧妙设计，避免了多个引物对及对应的检测探针之间的相互干扰；试剂盒结构简单，通过内标对待测样本的采集、运输和提取过程中进行监控，避免检测结果的假阴性。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物、试剂盒及方法
本专利技术涉及生物技术及医学检验
，尤其涉及一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物、试剂盒及方法。
技术介绍
新型冠状病毒(COVID-19)是一种具有包膜的正链单股RNA冠状病毒，此病毒每组基因组长度约30000个核苷酸左右，与SARS-CoV同属于冠状病毒谱系B(BetacoronavirusLineageB，Sarbecovirus)。与SARS-CoV类似，COVID-19可以借由人类的ACE2作为受体结合，通过呼吸道上皮细胞进入肺部进行复制过程，且主要作用对象也是与SARS-CoV相同的T淋巴细胞。其主要是通过与感染人员之间无防护的密切接触和飞沫传播，也可能会通过气溶胶传播。基本临床症状以发热、干咳、乏力为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。重症患者多发现于发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展成为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍及多器官功能衰竭。基于目前的流行病学调查，潜伏期1～14天，多为3～7天。该病毒所有人易感，暂无特效药。由于其高致死率和可能与其他病毒引起的感冒和肺炎症状相似，不利于疾病的防控和治疗，所以设计一种快速、准确、高通量的专门用于鉴别诊断该病毒的诊断试剂盒对社会意义重大。新型冠状病毒是RNA病毒，故其提取和保存过程容易破坏病毒核酸，导致检测出现假阴性。再者由于病毒的高变异性，如果引物探针设计不合理会造成假阴性。现有的病毒核酸检测方法主要有以下几种：荧光定量PCR法，主要用于体外定性检测病毒核酸，其样本主要为鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、肛拭子、粪便等。从样本提取到确认检测结果一般4～5小时。其具有灵敏度高，假阳性、假阴性率相对较低；有专家共识；窗口期相对较短；直接针对目标病毒且可以通过相对丰度来判断病毒感染的程度和用药后的效果等优势。测序法，该方法相对于PCR法时间更长，对实验室和专业的要求更高，检测成本更高，更利于对毒株的变异研究。恒温扩增法在检测时间上比PCR略短，灵敏度高，但其对引物的设计要求较高，整个行业发展和配套还不如PCR成熟，需要专业人员和设备，且具有更高的假阳性率。胶体金和化学发光法主要的检测物为血液中特异性的抗体，在临床上其具有检测时间短、速度快、检测成本较低的特点和检测窗口期较长的劣势。胶体金法具有不依赖专业人员和设备，操作简单的优势，也存在特异性差，灵敏度低，假阴性、假阳性率高的缺点。化学发光法相较于胶体金法灵敏度更高，但需要专门的设备和人员。虽然荧光定量PCR法检测新型冠状病毒具有速度快、通量大、通用性强和配套成熟的优势，但是其存在对人员专业要求高，需要专业的设备和实验室，检测成本高，样本需长距离运输容易破坏病毒核酸等劣势。
技术实现思路
本专利技术为了克服传统病毒核酸检测方法准确度低、特异性差，灵敏度低的问题，提供了一种准确度高、特异性好，灵敏度高的新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物，避免了多个引物对及对应的检测探针之间的相互干扰。本专利技术还提供了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒。本专利技术还提供了一种新型冠状病毒核酸检测方法，该方法特异性高、准确度高、灵敏度高。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：如表1所示，一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物，包括：第一引物探针组，包括正向引物ORF1ab-F，探针ORF1ab-P和反向引物ORF1ab-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.1～3所示；所述第一引物探针组以新型冠状病毒的ORF1ab基因为检测靶点；第二引物探针组，包括正向引物N-F，探针N-P和反向引物N-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.4～6所示；所述第二引物探针组以新型冠状病毒的N基因为检测靶点；第三引物探针组，包括正向引物Rpp30-F，探针Rpp30-P和反向引物Rpp30-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.7～9所示；所述第三引物探针组以人RPP30基因的mRNA为检测靶点。所述核苷酸序列不限于SEQIDNo.1～9所示，还包括与其反向互补序列及同源相似序列。表1.引物探针组合物本专利技术所提供的新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物是基于新型冠状病毒ORF1ab、N基因的引物探针和人源性样本管家基因Rpp30组合，通过扩增引物对及检测探针的巧妙设计，避免了多个引物对及对应的检测探针之间的相互干扰；并经证实，使用上述引物探针组合检测新型冠状病毒时，特异性好，灵敏度高。如表2所示，新型冠状病毒ORF1ab、N基因的引物探针根据中国国家疾病预防控制中心公布的新型冠状病毒COVID-19的基因序列SEQNo.10和SEQNo.11设计引物探针；人源性样本管家基因Rpp30的基因序列如SEQNo.12所示，人源性样本管家基因普遍存在于样本中，特异性高且高度保守。表2.靶标序列本专利技术的新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物的设计思路为：为了确保新型冠状病毒检测结果的准确性，选取病毒基因组中两个基因SEQIDNo10和SEQIDNo11作为靶标序列，设计特异的引物探针(SEQIDNo.1～6)进行扩增，检测人基因组DNA或其他病原体基因组无荧光扩增信号，检测新型冠状病毒基因组有荧光扩增信号。为排除假阴性、假阳性、污染及提取效率，选择人基因组mRNA(SEQIDNo12)作为靶标序列，设计特异的引物探针(SEQIDNo.7～9)进行扩增，检测病原体基因组无荧光扩增信号，检测人RPP30基因的mRNA有荧光扩增信号。作为优选，所述探针ORF1ab-P、探针N-P和探针Rpp30-P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团。作为优选，所述荧光基团选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、TexasRed和CY3中的至少1种。各探针所标记的荧光基团各不相同。作为优选，所述荧光淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和TAMRA中的至少1种。一种上述引物探针组合物的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包括引物探针组合物容器，内外质控容器，逆转录反应和PCR扩增反应容器，所述引物探针组合物容器内含有核苷酸序列如SEQIDNo.1～9所示的引物探针干粉或者溶液；所述内外质控容器内含有核苷酸序列如SEQIDNo.10～12所示的干粉或者溶液；所述逆转录反应和PCR扩增反应容器包括逆转录酶、DNA聚合酶、辅助增强剂和缓冲液。本专利技术的新型冠状病毒核酸检测试剂盒设置RnaseP的蛋白亚单位Rpp30作为内源性内标，采用CY5荧光素标记，通过内标对待测样本的采集、运输和提取过程中进行监控，避免检测结果的假阴性。作为优选，所述缓冲液的pH值控制在7.5～9.5(25℃)。作为优选，所述新型冠状病毒核酸检测试剂盒还包括阳性对照组和阴性对照组，所述阳性对照组为新型冠状病毒COVID-19核酸或者假病毒颗粒；所述阴性对照组为人源性样本管家基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物，其特征在于，包括：/n第一引物探针组，包括正向引物ORF1ab-F，探针ORF1ab-P和反向引物ORF1ab-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～3所示；/n第二引物探针组，包括正向引物N-F，探针N-P和反向引物N-R，其核苷酸序列分别如SEQID No.4～6所示；/n第三引物探针组，包括正向引物Rpp30-F，探针Rpp30-P和反向引物Rpp30-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.7～9所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物，其特征在于，包括：
第一引物探针组，包括正向引物ORF1ab-F，探针ORF1ab-P和反向引物ORF1ab-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.1～3所示；
第二引物探针组，包括正向引物N-F，探针N-P和反向引物N-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.4～6所示；
第三引物探针组，包括正向引物Rpp30-F，探针Rpp30-P和反向引物Rpp30-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.7～9所示。


2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物，其特征在于，所述探针ORF1ab-P、探针N-P和探针Rpp30-P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团。


3.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、TexasRed和CY3中的至少1种。


4.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和TAMRA中的至少1种。


5.一种包含如权利要求1-4任一所述的引物探针组合物的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，包括引物探针组合物容器，内外质控容器，逆转录反应和PCR扩增反应容器，所述引物探针组合物容器内含有核苷酸序列如SEQIDNo.1～9所示的引物探针干粉或者溶液；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：方耀东，陈林，李明阳，韩丽，张文学，古迪，
申请(专利权)人：上海五色石医学研究股份有限公司，上海五色石医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31