猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用。试剂盒包括用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针；其中，上游引物序列为5’‑TGGGCCTCCTAATGAATAGTTTT‑3’，下游引物序列为5’‑GAGACACAGAGCTATATTCAG AAG‑3’；TaqMan荧光标记探针序列为5’FAM‑CCAAGGAGACGACGACGC‑BHQ13’。本发明专利技术试剂盒可同时进行大批量样本的分析，灵敏度高、特异性好，用于快速定性/定量检测猪圆环病毒3型的感染或感染早期的任一种或其组合，更优选用于定量检测猪圆环病毒3型病毒拷贝数。

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用
本专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用。
技术介绍
猪圆环病毒病又叫仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)，是由猪圆环病毒(Porcinecircoviruses，PCV)感染引起的以猪只体质下降、消瘦、腹泻、呼吸困难、免疫抑制以及多病原继发感染为主要特征的一类病毒性传染病。猪圆环病毒是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb长，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcinecircovirusassociateddiseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征，肺炎、猪皮炎和肾病综合征及繁殖障碍，该病对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。而近几年，一种新型的猪圆环病毒，即猪圆环病毒3型(PCV3)首先在美国报道，该病毒基因组长为2.0kb，能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍以及心脏和多系统的炎症反应。近期，华中农业大学何启盖教授组在我国首次检出PCV3。研究人员通过大范围的检测发现，该病原可以在来自我国多个省份的样品中检测到，说明其在中国已广泛存在。而在检测到的PCV3阳性病料中，部分病料表现为PCV2和PCV3共感染。病毒分离是实验室确诊特定病原体感染的经典方法，但由于PCV3在PK15细胞或ST细胞上均不产生细胞病变，目前仍未有研究资料报道能够成功通过细胞分离到PCV3，而仅仅只是使用分子生物学检测方法检测到PCV3病毒核酸的存在，并进行测序鉴定。目前广泛应用的常规PCR检测方法简单快速，但容易出现交叉污染，容易产生假阳性，而隐性感染和混合感染的猪群中病毒含量可能并不高。因此，建立一种快速、准确、灵敏且操作简便的PCV3检测方法势在必行。新兴的实时荧光定量PCR技术不但克服了传统PCR技术存在的缺点，且具有结果直观可靠、特异性强、灵敏度高、快速简单等优点，可以直观地从分子生物学水平检测到病毒核酸的存在。该技术包括染料法和探针法两种，其中，染料法是利用能与双链DNA结合的染料(如SYBRGreen)结合到双链DNA产物内部，再根据检测到的荧光信号实现定量检测的目的，但存在无法区分引物二聚体及非特异产物信号的缺陷；探针法是在常规的PCR基础上加入一条特异性的荧光探针(如TaqMan探针)，根据探针两边标记的报告荧光基团和荧光淬灭基团之间产生的荧光共振能量转移原理，释放的荧光信号强度与扩增产物的量呈正比关系而实现定量检测。但是，实验室人员在使用实时荧光定量PCR技术时，通常需要分别购买荧光染料和酶体系，并花费大量时间用于设计合适的引物探针和优化反应体系等工作，且在目前的临床检测或科研实践中，尚没有开发出一种通过简单操作即能实现快速检测PCV3的试剂盒产品。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用，具体是指特异性检测猪圆环病毒3型的荧光定量PCR试剂盒及其在猪圆环病毒3型快速检测中的应用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了一种荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，其中，所述特异性引物对的上游引物序列为5’-TGGGCCTCCTAATGAATAGTTTT-3’，序列如SEQIDNO.1所示；特异性引物对的下游引物序列为5’-GAGACACAGAGCTATATTCAGAAG-3’，序列如SEQIDNO.2所示；所述TaqMan探针的序列为5’-CCAAGGAGACGACGACGC-3’，序列如SEQIDNO.3所示；且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1。本专利技术的优选技术方案中，所述特异性引物对和特异性的TaqMan探针被包括在PCR反应液中，其中，所述的PCR反应液是由1×PCRBuffer、0.5mmol/L的dNTP混合物、0.2μmol/L的TaqMan探针、0.2μmol/L的上游引物、0.2μmol/L的下游引物和无核酸酶水组成。本专利技术的优选技术方案中，所述试剂盒还包括TaqDNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品的任一组份或其组合。本专利技术的优选技术方案中，所述的阳性质控品为含有猪圆环病毒3型cap基因保守序列的T载体质粒。本专利技术的目的在于提供本专利技术的荧光定量PCR试剂盒用于检测待检样本中是否存在猪圆环病毒3型DNA的方法中的应用。本专利技术的目的还在于提供本专利技术的荧光定量PCR试剂盒用于快速定性/定量检测猪圆环病毒3型的方法中的应用，优选用于快速定性/定量检测猪圆环病毒3型的感染或猪圆环病毒3型感染早期的任一种或其组合，更优选用于定量检测猪圆环病毒3型病毒拷贝数。本专利技术所述的Ct值(Cyclethreshold，Ct)是指PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值(threshold)时所经过的扩增循环数，Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光到达阈值的循环数越少，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，再根据检测获得的待测样品的Ct值，即可由标准曲线计算待测样品的起始拷贝数。与现有技术相比，本专利技术具有下述有益技术效果：1、本专利技术优化了特异性检测猪圆环病毒3型感染的荧光定量PCR试剂盒的组成，包括优化了用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，还优化了包括特异性引物对和特异性的TaqMan探针的PCR反应液组成，所述的试剂盒具有特异性良好、灵敏度高、检测方便快速等优点。2、本专利技术的特异性检测猪圆环病毒3型感染的荧光定量PCR试剂盒的检测下限为1个拷贝/μl的病毒核酸量，具有检测灵敏度高的优点。3、本专利技术的特异性检测猪圆环病毒3型感染的荧光定量PCR技术中所用的TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记了本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1，降低了背景荧光信号，提高了信噪比，显著提高了实验结果的精确性。4、本专利技术的特异性检测猪圆环病毒3型感染的荧光定量PCR技术在整个扩增和检测过程均在同一个封闭管内进行，有效避免了气溶胶污染而造成的假阳性，具有操作简便、自动化、快速(整个检测过程仅需1～1.5小时)、准确等优点。附图说明图1是实施例1中第1组引物和探针的扩增曲线；其中：A、B、C、D分别是稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍的PCV3病毒核酸，E是水对照。图2～图5中的相关说明与此相同。图2是实施例1中第2组引物和探针的扩增曲线。图3是实施例1中第3组引物和探针的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针；其中，所述特异性引物对的上游引物序列，如SEQ ID NO.1所示；特异性引物对的下游引物序列，如SEQ IDNO.2所示；所述TaqMan探针的序列，如SEQ ID NO.3所示；且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1。/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针；其中，所述特异性引物对的上游引物序列，如SEQIDNO.1所示；特异性引物对的下游引物序列，如SEQIDNO.2所示；所述TaqMan探针的序列，如SEQIDNO.3所示；且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1。


2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述特异性引物对和特异性的TaqMan探针被包括在PCR反应液中；其中，所述的PCR反应液是由1×PCRBuffer、0.5mmol/L的dNTP混合物、0.2μmol/L的TaqMan探针、0.2μmol/L的上游引物、0.2μmol/L的下游引物和无核酸酶水组成。


3.根据权利要求1或2所述的荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Ta...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛霜，徐松，万佳，徐丹丹，李婷婷，谢红玲，朱薇，漆世华，石宝兰，李晶梅，
申请(专利权)人：国药集团动物保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42