本发明专利技术属于人核酸体外检测技术领域，具体为人ATP7b基因的PCR扩增检测系统及其应用。PCR扩增检测系统包括：引物组、PCR反应母液容器及Sanger Sequencing后的序列分析；引物组容器包含引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.42贮存液。本发明专利技术在DNA提取情况后(DNA质量满足要求：1.6≤OD260/OD280≤2.0，DNA最低浓度≥10.0ng/μL)，通过PCR反应对人ATP7b基因21个外显子目的片段同时扩增，通过目的片段的琼脂糖凝胶电泳进行ATP7b基因外显子有无缺失突变的判断，进而进行电泳凝胶DNA的回收纯化进行一代测序，通过测序片段的基因序列与Reference Sequence(权威数据库中参考序列)进行比对，最终进行目标序列中有无单碱基突变的判断，以期对人ATP7b基因全部外显子进行金标准方法探讨分析肝豆状核变性在分子遗传水平上的发病原因。而且，本方法操作简单，使用仪器设备普及度很高，适合推广使用。
【技术实现步骤摘要】
一种人ATP7b基因外显子PCR扩增系统、检测试剂盒及其应用的方法
本专利技术属于人核酸体外检测
，具体涉及人ATP7b基因21个外显子PCR扩增及其应用。
技术介绍
肝豆状核变性(HepatolenticularDegeneration，HLD或WilsonDisease，WD)是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍病，以铜代谢障碍引起的肝硬化、基底节损害为主的脑变性疾病为特点。肝豆状核变性在世界范围内的发病率在15～25/100万，杂合子频率约1:100。肝豆状核性变是少数可以干预、治疗的遗传代谢疾病，早期发现，早期诊断和早期治疗对于症状前患者、临床出现症状患者预后有极其重要意义。目前已经明确WD基因(ATP7b)定位于13q14.3(图1.A)，基因全长4.2Kb，含有21个外显子(图1.B)和20个内含子，其cDNA编码由1411氨基酸组成的P型Cu转运ATP酶(ATP7Base)(图1.C)，参与Cu的跨膜转运过程，故又称为ATP7b基因，ATP7b基因以点突变为主，已发现600多种突变，大多是杂合突变。ATP7b基因内一个或多个外显子突变是导致肝豆状核变性的根本原因，在国内外的诸多研究显示，ATP7b基因突变呈现地域差异及人种差异。在欧美国家，肝豆状核性变基因Exon14第1069位密码子突变是一个典型的热点突变，突变频率高达68.3％，而国内学者对中国WD患者基因突变研究显示Exon8的Arg778Leu突变频率高达60％，为公认的第一突变热点。目前关于ATP7b基因突变的检测方法，国内外常用的分子检测方法有:Sanger测序和DHPLC。SangerSequencing是通过设计ATP7b基因的21个外显子或部分已知的突变热点外显子区域引物，以基因组DNA为模板进行常规PCR，PCR产物经过琼脂糖电泳确认电泳条带后进行一代测序，测序结果与参考序列进行比对，最终确认目标扩增区域是否具有突变发生，该方法目前也是被认定为WD患者基因检测的金标准。在此方法基础上进行设计的如PCR-RFLP、STR等方法也常常被用于ATP7b基因的联合分析。变性高效液相色谱(Denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)是一种高通量筛选DNA序列变异的新技术，DHPLC是近来发展起来探索人类基因组DNA序列变异的新手段，亦称为温度调节的杂合双链分析(TMHA)。它利用在部分变性条件下同源、异源双链DNA解链特征的差异进行变异检测。可以敏感而准确地发现DNA变异，能自动化操作，并能在数分钟内快速获取实验数据，且不存在假阳性或假阴性的问题，适用于大量人群筛选。该技术的高准确性和高敏感性在多种基因微小突变及多态性(SNPs)的研究中得到证实，因此，对于ATP7b这样一个异质性基因来说，DHPLC为一个理想方法，在实际临床检测方面应用较广。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成本低、效率高、覆盖全的能够对人ATP7b基因进行突变检测的扩增系统，以及ATP7b基因突变筛查，辅以肝豆状核变性致病的诊断分析。本专利技术第一方面提供了一种对用于人ATP7b基因21个外显子的PCR扩增系统，所述扩增系统包含以下外显子位点相对应的23对引物：位点Exon1，相对应的引物序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；位点Exon2-1，相对应的引物序列为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4；位点Exon2-2，相对应的引物序列为SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；位点Exon2-3，相对应的引物序列为SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；位点Exon3，相对应的引物序列为SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；位点Exon4，相对应的引物序列为SEQIDNo.11和SEQIDNo.12；位点Exon5，相对应的引物序列为SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；位点Exon6，相对应的引物序列为SEQIDNo.15和SEQIDNo.16；位点Exon7，相对应的引物序列为SEQIDNo.17和SEQIDNo.18；位点Exon8，相对应的引物序列为SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；位点Exon9，相对应的引物序列为SEQIDNo.21和SEQIDNo.22；位点Exon10，相对应的引物序列为SEQIDNo.23和SEQIDNo.24；位点Exon11，相对应的引物序列为SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；位点Exon12，相对应的引物序列为SEQIDNo.27和SEQIDNo.28；位点Exon13，相对应的引物序列为SEQIDNo.29和SEQIDNo.30；位点Exon14，相对应的引物序列为SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；位点Exon15，相对应的引物序列为SEQIDNo.33和SEQIDNo.34；位点Exon16，相对应的引物序列为SEQIDNo.35和SEQIDNo.36；位点Exon17，相对应的引物序列为SEQIDNo.37和SEQIDNo.38；位点Exon18，相对应的引物序列为SEQIDNo.39和SEQIDNo.40；位点Exon19，相对应的引物序列为SEQIDNo.41和SEQIDNo.42；位点Exon20，相对应的引物序列为SEQIDNo.43和SEQIDNo.44；位点Exon21，相对应的引物序列为SEQIDNo.45和SEQIDNo.46。上述23对引物覆盖99％以上的ATP7b基因突变(缺失、重复、碱基突变等)，该23个位点相应的PCR扩增引物的信息详见表1。表1.21个外显子46条PCR扩增引物信息本专利技术所述的PCR扩增系统中，引物由SEQIDNo.1至SEQIDNo.46所示寡核苷酸序列的PCR扩增引物的干粉或溶液组成。所述23对PCR扩增引物的工作液浓度为50～400nmol/L。本专利技术第二方面提供了本专利技术第一方面所述PCR扩增系统在制备对人ATP7b基因21个外显子检测的试剂盒的用途。本专利技术第三方面提供了一种对人ATP7b基因21个外显子检测的试剂盒，其包含含有本专利技术第一方面所述PCR扩增系统的引物组合物容器和PCR反应母液容器；其中：所述引物组合物容器包含序列为SEQIDNo.1至SEQIDNo.46所示的引物的贮存液，贮存液中各引物的浓度为相应引物工作液浓度的2～10倍；所述PCR反应母液容器内含有进行PCR反应的2～5倍反应浓度的PCR反应母液，PCR反应母液包含酶活为0.5～5U的DNA聚合酶、浓度为1～5mmol/L的镁离子、浓度为40～400μmol/L的dNTP及浓度为20～100mmol/L的Tris-HCl缓冲液。本专利技术第四方面提供了一种本专利技术第三方面所述试剂盒的使用方法，具体如下：(1)多重PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：(2)PCR反应在普通PCR仪进行，PCR反应条件如下：95℃10分钟启动后，94℃30秒、60℃45秒、72℃45秒，共32个循环，然后70℃延伸10分钟，最后4℃保温；(3)PCR产物取10μL，按常规操作在琼脂糖凝胶电泳仪上进行横向电泳，得到每一个外显子PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。在另一优选例中，所述基因组DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于人ATP7b基因21个外显子的PCR扩增系统，所述扩增系统包含以下外显子位点相对应的23对PCR扩增引物：位点Exon1，相对应的引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；位点Exon2‑1，相对应的引物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；位点Exon2‑2，相对应的引物序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；位点Exon2‑3，相对应的引物序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；位点Exon3，相对应的引物序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；位点Exon4，相对应的引物序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；位点Exon5，相对应的引物序列为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；位点Exon6，相对应的引物序列为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；位点Exon7，相对应的引物序列为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；位点Exon8，相对应的引物序列为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20；位点Exon9，相对应的引物序列为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22；位点Exon10，相对应的引物序列为SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；位点Exon11，相对应的引物序列为SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；位点Exon12，相对应的引物序列为SEQ ID No.27和SEQ ID No.28；位点Exon13，相对应的引物序列为SEQ ID No.29和SEQ ID No.30；位点Exon14，相对应的引物序列为SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；位点Exon15，相对应的引物序列为SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；位点Exon16，相对应的引物序列为SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；位点Exon17，相对应的引物序列为SEQ ID No.37和SEQ ID No.38；位点Exon18，相对应的引物序列为SEQ ID No.39和SEQ ID No.40；位点Exon19，相对应的引物序列为SEQ ID No.41和SEQ ID No.42；位点Exon20，相对应的引物序列为SEQ ID No.43和SEQ ID No.44；位点Exon21，相对应的引物序列为SEQ ID No.45和SEQ ID No.46。...
【技术特征摘要】
1.一种用于人ATP7b基因21个外显子的PCR扩增系统，所述扩增系统包含以下外显子位点相对应的23对PCR扩增引物：位点Exon1，相对应的引物序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；位点Exon2-1，相对应的引物序列为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4；位点Exon2-2，相对应的引物序列为SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；位点Exon2-3，相对应的引物序列为SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；位点Exon3，相对应的引物序列为SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；位点Exon4，相对应的引物序列为SEQIDNo.11和SEQIDNo.12；位点Exon5，相对应的引物序列为SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；位点Exon6，相对应的引物序列为SEQIDNo.15和SEQIDNo.16；位点Exon7，相对应的引物序列为SEQIDNo.17和SEQIDNo.18；位点Exon8，相对应的引物序列为SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；位点Exon9，相对应的引物序列为SEQIDNo.21和SEQIDNo.22；位点Exon10，相对应的引物序列为SEQIDNo.23和SEQIDNo.24；位点Exon11，相对应的引物序列为SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；位点Exon12，相对应的引物序列为SEQIDNo.27和SEQIDNo.28；位点Exon13，相对应的引物序列为SEQIDNo.29和SEQIDNo.30；位点Exon14，相对应的引物序列为SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；位点Exon15，相对应的引物序列为SEQIDNo.33和SEQIDNo.34；位点Exon16，相对应的引物序列为SEQIDNo.35和SEQIDNo.36；位点Exon17，相对应的引物序列为SEQIDNo.37和SEQIDNo.38；位点Exon18，相对应的引物序列为SEQIDNo.39和SEQIDNo.40；位点Exon1...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭朝敏，金云舟，周巍，陈林，李明阳，邓淑燕，
申请(专利权)人：上海五色石医学研究股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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