本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒(2019‑nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒，包括特异性引物2019‑nCoV‑1ab‑F和2019‑nCoV‑1ab‑R，以及探针2019‑nCoV‑1ab‑P，用THF残基，[FAM‑dT]荧光团和[BHQ1‑dT]淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基，并在探针3’端标记[C3‑Spacer]作为阻断基团，试剂中的核酸外切酶可在THF位点裂解探针，从而分离荧光基团和淬灭基团并产生荧光信号。本发明专利技术提供的试剂盒可在20min内实现新型冠状病毒的检测，特异性为100％，检测敏感性为10copies/μl。因此，本发明专利技术的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点。
【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒
本专利技术涉及一种新型冠状病毒恒温荧光检测法，具体地说，涉及一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒检测方法的建立及应用方法，属于生物工程
技术介绍
新型冠状病毒肺炎(CoronaVirusDisease2019，COVID-19)是由冠状病毒2019-nCoV引起的人的一种传染病，主要症状为发热、乏力、咳嗽、呼吸不畅，在较严重病例中，可导致严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。主要传播方式为飞沫传播和接触传播，任何年龄段均易感。现已将该病纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。自2019年12月中旬至2020年5月，新型冠状病毒肺炎疫情已波及200多个国家和地区，全球累计确诊病例379万，累计死亡病例超26万，严重威胁全人类的生命健康，给全球经济带来巨大影响。由于尚无有效的疫苗防治，所以建立一种快速、准确的检测方法就显得尤为重要。重组酶介导链替换核酸扩增技术(Recombinase-aidAmplification，RAA)，是一种恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。反应可在37～42℃下连续进行反应，反应时间只需5～20分钟，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，非常适用于临床快速诊断。实时荧光RAA技术是RAA基础反应体系与荧光探针结合起来的一种联用技术，通过在反应体系中加入一个核酸外切酶Ⅲ和荧光探针对模板扩增实现实时监测。与实时定量PCR比较，两者具有相同的灵敏度与特异性，而Real-timeRAA检测过程明显缩短，荧光强度信号实时检测可由荧光信号检测器或扫描仪完成，是目前RAA技术应用最为广泛的检测方法。作为一种新型核酸等温扩增技术，RAA技术在国内外已经有大量的研究和报道，具有敏感性强、特异性高、检测时间短的显著特点。Boyle等应用Real-timeRAA检测结核分枝杆菌复合群(MTC)的DNA，可在20min内检测到低至6.25fg的DNA模板，其准确性也远远大于荧光显微镜检测；Wahed等将RT-RAA技术应用于手足口病病毒的快速诊断，在埃及2013年的手足口病爆发中，该技术被成功应用于现场FMDV的快速检测和疫情控制；哈登楚日亚等利用Real-timeRAA用于非洲猪瘟病毒的定性检测，可在39℃、20min内最低检测10个拷贝的DNA分子。基于此，本专利技术依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》选取2019-nCoV保守的ORF1ab基因作为靶基因，设计特异性引物及探针建立2019-nCoV特异的荧光型RAA检测方法。本专利技术的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒在整个检测过程中，从DNA提取到出现检测结果，则只需25min，大大减少手工操作和缩短时间。且本专利技术一次可检测多个样品，特别适合于大批样品的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒，实现2019-nCoV的快速检测。本专利技术在检测2019-nCoV的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，只需25min，大大缩短检测时间，提高检测效率。为实现上述目的，本专利技术提供一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒，具体步骤如下：(1)参考公布的2019-nCoV的77个基因型参考毒株序列，筛选ORF1ab基因保守区域，设计特异性引物2019-nCoV-1ab-F和2019-nCoV-1ab-R，以及探针2019-nCoV-1ab-P，用四氢呋喃(THF残基)，[FAM-dT]荧光团和[BHQ1-dT]淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基，并在探针3’端标记[C3-Spacer]作为阻断基团，其中特异性引物和探针序列如下：2019-nCoV-1ab-F:5′-TTGAGTATTGCCCTATTTTCTTCATAACTG-3′；2019-nCoV-1ab-R:5′-AACTCCTGTGTAGAAACTAAGTAATCATAA-3′；2019-nCoV-1ab-P:5-TTACTTTGGCCTCTTTTGTTTACTCAACCGC[FAM-dT]A[THF][BHQ1-dT]TTAGACTGACTCTTG[C3-Spacer]-3′。(2)经过大量实验，优化反应条件，试剂最佳引物探针浓度为20μmol/L2019-nCoV-1ab-F/2019-nCoV-1ab-R各1.5μL，20μmol/LASFV-P1μL，引物、探针与反应所需的酶冻干制成荧光型干粉反应管。在荧光型干粉反应管中加入42.5μL水解缓冲液，5μL阳性对照/阴性对照/待检核酸，在反应管盖上加2.5μL醋酸镁，盖上管盖，瞬时离心，上下颠倒混匀，离心10秒，立即检测。反应程序为：39℃30秒，40个循环，此处采集FAM荧光信号。本专利技术提供的试剂盒能够用于检测新型冠状病毒核酸(2019-nCoV)，可以用于疑似感染人员的咽拭子、血液或血清等样本中新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的检测。(3)灵敏度验证：将阳性对照质粒倍比稀释为10-1～10-6，按(2)中方法进行检测，验证本试剂盒的灵敏度。(4)特异性验证：按(2)中方法对牛冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、犬呼吸道型冠状病毒核酸进行检测，验证本试剂盒的特异性。本专利技术提供的试剂盒是恒温扩增反应，在39℃条件下即可实现靶基因的有效扩增，可在20min内实现型冠状病毒(2019-nCoV)的检测，特异性为100％，检测敏感性为10copies/μl。因此，本专利技术的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点，为型冠状病毒(2019-nCoV)的快速检测筛查提供有效的技术手段。附图说明图1为第一次引物筛选示意图。图2为第二次引物筛选示意图。图3为第三次引物筛选示意图。具体实施方式以下对本专利技术做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒引物及探针的设计：(1)靶基因的筛选通过GenBank/NMDC/GenomeWarehouse/GISAID四个基因序列数据库，共下载截止到2020年2月2日所公布的全部的77株新型冠状病毒基因组序列。(见表1)，应用DNASTARLasergene软件进行ORF1ab基因序列保守性分析，同时筛选GC含量在40％～60％、没有正向/反向重复序列、回文序列的保守区域作为靶基因的候选区域。通过比对分析，选择新型冠状病毒毒株(Gen本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒，包括特异性引物2019-nCoV-1ab-F和2019-nCoV-1ab-R，以及探针2019-nCoV-1ab-P，探针标记的报告荧光染料为FAM，标记的荧光淬灭基团为BHQ-1；其中特异性引物和探针序列如下：/n2019-nCoV-1ab-F:5′-TTGAGTATTGCCCTATTTTCTTCATAACTG-3′；/n2019-nCoV-1ab-R:5′-AACTCCTGTGTAGAAACTAAGTAATCATAA-3′；/n2019-nCoV-1ab-P:5′-TTACTTTGGCCTCTTTTGTTTACTCAACCGC[FAM-dT]A[THF][BHQ1-dT]TTAGACTGACTCTTG[C3-Spacer]-3′。/n
【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒，包括特异性引物2019-nCoV-1ab-F和2019-nCoV-1ab-R，以及探针2019-nCoV-1ab-P，探针标记的报告荧光染料为FAM，标记的荧光淬灭基团为BHQ-1；其中特异性引物和探针序列如下：
2019-nCoV-1ab-F:5′-TTGAGTATTGCCCTATTTTCTTCATAACTG-3′；
2019-nCoV-1ab-R:5′-AACTCCTGTGTAGAAACTAAGTAATCATAA-3′；
2019-nCoV-1ab-P:5′-TTACTTTGGCCTCTTTTGTTTACTCAACCGC[FAM-dT]A[THF][BHQ1-dT]TTAGACTGACTCTTG[C3-Spacer]-3′。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括荧光型干粉反应管、BufferA、BufferB，阴性对照以及阳性对照；所述的荧光型干粉反应管含有重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶冻干粉；BufferA为水解缓冲液；BufferB为醋酸镁溶液；阳性对照为含有新型冠状病毒ORF1ab靶基因序列的质粒；阴性对照为空载体质粒。
3.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)人工合成2019-nCoV新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b(openreadingframe1ab，ORF1ab)靶基因序列克隆到pUC57载体上，经大肠杆菌工程菌纯培养后提取质粒作为阳性对照；
(2)引物组和探针制备：
根据ORF1ab基因靶序列，设计特异性引物2019...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵林萍，娄亚坤，陈小鸽，付燕峰，常伟，徐恒岗，贾松涛，任宝红，曾小宇，杨楠，
申请(专利权)人：郑州中道生物技术有限公司，河南中标检测服务有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41
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