含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术公开了含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体T细胞及其应用，属于肿瘤免疫治疗领域。本发明专利技术的双功能免疫分子包含两部分，由具有PD‑L1阻断功能的多肽以及调控双嵌合抗原受体T细胞的FITC分子共同构成。通过体外和体内试验，证实了构建的双功能开关分子可以精准的调控双嵌合抗原受体T细胞的激活和靶细胞毒性，同时还可以延长双嵌合抗原受体T细胞的增值能力，并增强其抗肿瘤活性。这种联合调控方式能够显著提高CAR‑T细胞免疫治疗的安全性和在实体瘤中的肿瘤清除能力。

【技术实现步骤摘要】
含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体T细胞及其应用
本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域，具体来说，涉及一种调控双嵌合抗原受体T细胞活性的双功能免疫开关分子的构建方法及其应用。背景：基于嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞的免疫疗法被证明是一种有希望的癌症治疗手段，尤其是在B细胞恶性肿瘤中取得了空前的成功。CAR通过表面展示的单链可变区与胞内的共刺激和激活结构域来赋予T细胞识别和清除肿瘤的能力。尽管CAR-T细胞疗法在B细胞急性淋巴细胞性白血病患者中展现出了显著疗效，但其在治疗实体瘤中的效果却不尽人意。CAR-T细胞的应用主要受制于实体瘤肿瘤微环境以及脱靶效应。实体瘤肿瘤微环境中发挥抑制免疫活性的细胞及相关配体会使浸润的T细胞丧失抗肿瘤活性，从而造成肿瘤的免疫逃逸。例如在乳腺癌中，肿瘤微环境中包含大量肿瘤相关巨噬细胞和调节性T细胞，他们通过与T细胞接触或是通过分泌抑制性的细胞因子，削弱T细胞的抗肿瘤活性，造成患者抗肿瘤免疫反应失效。此外，激活的T细胞分泌大量效应细胞因子IFNγ，造成乳腺肿瘤PD-L1表达升高。而PD-L1与T细胞表面抑制性受体PD-1结合，会抑制T细胞的抗肿瘤活性。目前，检查点阻断疗法，尤其针对PD-1/PD-L1，其通过抗体阻断T细胞抑制性信号通路，已经被证明在一系列肿瘤治疗中产生了临床响应。而通过将CAR-T细胞疗法与PD-1/PD-L1抗体联合，通过CAR-T细胞自分泌PD-1/PD-L1抗体，以及通过CRISPR介导的PD-1-敲除CAR-T细胞已经在临床前或是临床研究中展现出积极的结果。r>对于脱靶效应，由于实体瘤相关抗原往往在一系列正常组织中也表达，导致临床上将CAR-T细胞应用与实体瘤治疗时产生了严重的毒性。例如一个乳腺癌患者在回输靶向HER-2的CAR-T细胞后产生了致命的炎性细胞因子释放，就是因为肺表皮细胞上也表达HER-2。目前有许多措施来控制CAR-T细胞的活性，包括引入自杀基因，采用双抗原受体，外源开关分子控制控制CAR-T细胞活性。此外，我们先前的研究介绍了一种可调节双受体CAR系统，其活性依赖于双抗原且严格受控于开关分子[1]。具体来说，T细胞受双嵌合抗原受体共同调控，功能性开关分子控制的第一嵌合抗原受体(CD3ζ胞内信号域)及肿瘤相关抗原MSLN控制的第二嵌合抗原受体(4-1BB胞内信号域)。而开关分子作为效靶细胞间的桥梁，控制着可调节双受体CAR-T细胞的激活及靶细胞清除。
技术实现思路
要解决的问题针对目前CAR-T细胞治疗过程中出现的脱靶毒性及免疫抑制，本专利技术提供了一种双功能免疫开关分子，其一方面具有调控双受体CAR-T细胞活性的功能，此种CAR-T细胞需同时识别MSLN，PD-L1双抗原及双功能开关分子才可以被激活，从而降低了脱靶毒性的风险。另一方面双功能开关分子具有PD-L1阻断活性，从而解除CAR-T细胞的抑制状态，更好的发挥抗肿瘤活性。总之，通过设计的双功能免疫开关分子，可以同时解决双受体CAR-T细胞脱靶效应及免疫抑制状态，扩大了CAR-T细胞在实体肿瘤中的应用。技术方案为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种双功能免疫开关分子，其特征在于，其含有双嵌合抗原受体的调控区域和免疫检查点抑制区域。所述的一种双功能免疫开关分子，其特征在于：免疫检查点抑制区域为PD-L1阻断多肽，所述多肽的序列为：SEQIDNO.1。所述的一种双功能免疫开关分子，其特征在于：双嵌合抗原受体调控区域为偶联的FITC分子。所述的一种双功能免疫开关分子，其特征在于：其序列为FITC-Acp-SNGLSQPV；含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体T细胞，其特征在于：其含有所述的双功能免疫开关分子、第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体；其中第一嵌合抗原受体由CD8α信号肽，FITCscFv(SEQIDNO.6)，CD8α铰链区与跨膜区，CD3ζ胞内信号域串联构成，所述第一嵌合抗原受体的氨基酸序列为：SEQIDNO.2；所述的第二嵌合抗原受体由CD8α信号肽，MSLNscFv(SEQIDNO.5)，CD8α铰链区与跨膜区，4-1BB胞内信号域串联构成，所述第二嵌合抗原受体的氨基酸序列为：SEQIDNO.3；所述的含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体T细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤包括卵巢癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、头颈癌、宫颈癌和骨肉瘤。更进一步地，一种转染制备能够表达双嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于：将所述的双嵌合抗原受体基因连接到过表达载体中，通过包装慢病毒，将目的基因转入到原代T淋巴细胞中，使得T细胞表达双嵌合抗原受体；更进一步地，所述的含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体T细胞在制备治疗过表达肿瘤抗原MSLN和PD-L1的肿瘤药物领域中的应用。所述的应用，其特征在于所述的含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体T细胞可通过多种给药方式治疗癌症，包括皮下或静脉注射，肌肉注射，瘤内注射。一种肿瘤细胞治疗药物组合，其特征在于，包括的双功能开关分子，或双嵌合抗原受体T细胞，以及药学上可接受的辅料。作用机理：如图3示意图所示，本专利技术中包括可调节双嵌合抗原受体(即sdCAR)T细胞(sdCAR-T细胞)包含双嵌合抗原受体和双功能免疫开关分子(即DT301)，sdCAR包括第一和第二嵌合抗原受体；其中第一嵌合抗原受体主要包括胞外的FITCscFv识别区及胞内的CD3ζ信号域等，主要识别DT301中的FITC部分；第二嵌合抗原受体主要包括胞外的MSLNscFv识别区及胞内的4-1BB信号域，主要识别肿瘤细胞表面的MSLN。因此，这种sdCAR-T细胞必须同时识别DT301的FITC即MSLN双抗原后才可以被充分激活，有效降低脱靶效应发生的概率。此外，DT301由两部分构成，分别为PD-L1阻断多肽以及偶联的FITC分子，是一种起到开关作用的分子，即通过添加DT301实现CAR-T细胞启动，具体来说一方面，外源添加DT301后，其通过PD-L1阻断多肽与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，从而将偶联的FITC分子锚定在肿瘤细胞表面，进而可以通过FITC分子与肿瘤细胞本身表达的MSLN分子共同调控sdCAR-T细胞的激活，因此sdCAR-T细胞只有在添加DT301后才可以被充分激活，有效增加了sdCAR-T细胞的可控性。在具体的抗肿瘤过程中，只有当肿瘤细胞同时表达MSLN及PD-L1时，添加DT301后，DT301与PD-L1结合，这时sdCAR-T细胞通过识别MSLN及FITC抗原得以激活，从而发挥抗肿瘤作用，而不添加DT301，或是肿瘤细胞不同时表达MSLN和PD-L1抗原，sdCAR-T细胞不能被激活，这些结果如图5-8所示，因此安全性明显得到提高。而在sdCAR-T细胞的长期在体外被同时表达MSLN和PD-L1的肿瘤细胞刺激并且添加DT301后，其增殖活性明显强于MSLNCAR-T细胞，这表明在长期本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双功能免疫开关分子，其特征在于，其含有双嵌合抗原受体的调控区域和免疫检查点抑制区域。/n

【技术特征摘要】
1.一种双功能免疫开关分子，其特征在于，其含有双嵌合抗原受体的调控区域和免疫检查点抑制区域。


2.根据权利要求1所述的一种双功能免疫开关分子，其特征在于：免疫检查点抑制区域为PD-L1阻断多肽，所述多肽的序列为：SEQIDNO.1。


3.根据权利要求1所述的一种双功能免疫开关分子，其特征在于：双嵌合抗原受体调控区域为偶联的FITC分子。


4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种双功能免疫开关分子，其特征在于：其序列为FITC-Acp-SNGLSQPV。


5.一种双嵌合抗原受体，其特征在于含有第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体；第一嵌合抗原受体包括CD8α信号肽，FITCscFv，CD8α铰链区与跨膜区，CD3ζ胞内信号域，所述的FITCscFv的氨基酸序列为SEQIDNO.6;所述的第二嵌合抗原受体包括CD8α信号肽，MSLNscFv，CD8α铰链区与跨膜区，4-1BB胞内信号域，MSLNscFv的氨基酸序列为SEQIDNO.5。


6.根据权利要求5所述的一种双嵌合抗原受体，其特征在于所述的双嵌合抗原受体通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐寒梅，杨培伟，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32