一种可自分泌TLR4 scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种可自分泌TLR4 scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用；本发明专利技术的T细胞含有识别cMet的嵌合抗原受体的编码序列和具有分泌信号肽的TLR4 scFv抗体的编码序列；本发明专利技术的经嵌合抗原受体修饰的T细胞可特异性的靶向cMet高表达的肿瘤细胞的同时，活化T细胞，并自分泌TLR4 scFv抗体，减弱肿瘤微环境的免疫抑制作用，降低Treg细胞的表达，促进CD8

【技术实现步骤摘要】
一种可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种具有自分泌抗体功能的特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，近年来嵌合抗原受体T细胞免疫治疗(chimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy,CAR-T)(为代表的肿瘤免疫细胞治疗引起了学界的广泛关注，有望成为免疫治疗的重大突破。CAR-T细胞是通过构建特异性嵌合抗原受体载体，将抗体的高亲和性和T细胞的杀伤作用相结合，经基因修饰的抗体与相应的肿瘤抗原结合后能以主要组织相容性复合体非限制性方式(MHC)使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。根据胞内信号传导区域的组成可将CAR-T细胞分为三代。第一代嵌合抗原受体(CAR)由肿瘤相关抗原接合区、胞外铰链区、跨膜区以及免疫受体络氨酸活化基序(ITAM，通常为CD3)组成。由于胞内部分仅含CD3δ结构域，虽然能诱导T细胞的激活和最初的细胞毒性反应，但是存活时间短,效果不佳；第二代CAR-T细胞将共刺激分子如CD28、CD137的胞内部分融合到CD3δ结构域的上游，效果较一代明显增强；第三代CAR-T细胞则同时融合两种共刺激分子到CD3δ结构域，形成scFv-CD28-CD134-CD3δ或scFv-CD28-CD137-CD3δ结构，从而可以提供长时间的T细胞扩增信号，延长CAR-T细胞在体内的存活时间。目前CAR-T细胞疗法在血液病的治疗上取得了较好的疗效，但在实体瘤治疗方面仍处于研究阶段。目前肿瘤免疫治疗效果不佳的重要原因之一是肿瘤组织免疫抑制性微环境的存在，即肿瘤组织可以利用肿瘤微环境来改变和维持自身生存和发展的条件，达到逃避免疫调控的目的，进而促进肿瘤的发生发展。因此单独针对肿瘤抗原的CAR-T疗效不佳，而且容易复发。c-Met是肝细胞生长因子(HGF)的高亲和性受体，在肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤组织中异常高表达、突变或活性改变，而在正常组织中则低表达或不表达。c-Met在肝癌组织中高表达，且多表达于低、中分化肝癌，c-Met基因表达与肝癌肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、远处转移等相关，c-Met基因高表达预示着肝癌病人的预后不良。由于c-Met是许多肿瘤信号通路的交叉点，以c-Met为靶标可阻断肝癌细胞中异常活化的HGF/c-Met信号通路，使肿瘤细胞出现形态改变、增殖减缓、成瘤性降低、侵袭能力下降等一系列的变化。Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR4)是Toll样受体家族的成员之一,是一类模式识别受体。目前的研究证明TLR4能够被脂多糖(LPS)和热休克蛋白70(HSP70)所激活，引起下游NF-κB、PI3K/Akt、EGFR等信号通路的活化，促进PGE2、VEGF、IL-6、IL-8等多种细胞因子的分泌，诱导损伤部位的炎性细胞浸润，最终加速肿瘤的发生。有研究表明TLR4亦表达于CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞表面，其信号途径能够直接影响Treg细胞的数量和功能。内毒素LPS激活TLR4后可以增强10倍CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞的抑制效能。同时，TLR4的激活可以促进一些炎症因子的释放，通过上调CD80等共刺激分子的表达，间接促进CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞的增殖。目前，以c-Met为靶点，同时整合具有自分泌且具有中和作用的抗TLR4抗体的嵌合抗原受体及相关经修饰的T细胞免疫疗法尚未有研究报道。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于提供一种能够有效调节肿瘤微环境的特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，本专利技术所得的特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞可以特异性识别并杀伤表达c-Met基因的肿瘤细胞，同时自分泌出TLR4scfv抗体，抑制Treg细胞的增殖，从而加强对肿瘤细胞的杀伤功能。本专利技术的目的之二，在于提供包含可以分泌TLR4scFv、靶向cMet的嵌合抗原受体的慢病毒载体。本专利技术的目的之三，在于提供利用所述包含能够分泌TLR4scFv、靶向cMet的嵌合抗原受体的慢病毒载体制备的表达具有自分泌TLR4scFv的嵌合抗原受体的免疫细胞。本专利技术的目的之四，在于提供具有自分泌TLR4scFv的嵌合抗原受体在抗肿瘤免疫细胞治疗中的应用。本专利技术通过如下技术方案予以实现上述目的：所述T淋巴细胞表面表达特异性嵌合抗原受体，其中的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原例如包括：AFP、BCMA、B7H4、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、G250、GAGE、GnTV、HAGE、HER2、HPVE7、HSP70、hTERT、iCE、IGF1R、IL2R、IL5、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART1、MART2、Mesothelin、MUCl、PRAME、PSMA、RAGE、SAGE、TGFf3、TPI/m、VEGF、WTl等等；本专利技术在优选后，所述的特异性分泌型嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，所选取的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为c-Met。本专利技术提供一种可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体(CsTCAR)，由CD8α嵌合受体信号肽、cMet单链抗体轻链可变区、Linker区、cMet单链抗体重链可变区、人CD8α跨膜区、CD137嵌合受体共刺激因子、免疫受体络氨酸活化基序CD3δ、T2A自剪切肽段、VH3-3抗体信号肽、TLR4抗体重链可变区、Linker区、TLR4抗体轻链可变区串联组成。优选地，所述可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。优选地，所述可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体的CD8α嵌合受体信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；优选地，所述可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体的CD8α嵌合受体信号肽的编码核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；优选地，所述可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体的cMetscFv的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；优选地，所述可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体的cMetscFv的编码核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；优选地，所述可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体的人CD8α跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；优选地，所述可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体的人CD8α跨膜区的编码核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；优选地，所述可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体的CD137嵌合受体共刺激因子的氨基酸序列如SEQIDNO.6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可自分泌TLR4 scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体，其特征在于：嵌合抗原受体由CD8α嵌合受体信号肽、cMet单链抗体轻链可变区、Linker区、cMet单链抗体重链可变区、人CD8α跨膜区、CD137嵌合受体共刺激因子、免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ、T2A自剪切肽段、VH3-3抗体信号肽、TLR4抗体重链可变区、Linker区以及TLR4抗体轻链可变区串联构成。/n

【技术特征摘要】
1.一种可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体，其特征在于：嵌合抗原受体由CD8α嵌合受体信号肽、cMet单链抗体轻链可变区、Linker区、cMet单链抗体重链可变区、人CD8α跨膜区、CD137嵌合受体共刺激因子、免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ、T2A自剪切肽段、VH3-3抗体信号肽、TLR4抗体重链可变区、Linker区以及TLR4抗体轻链可变区串联构成。


2.根据权利要求1所述的一种可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求1所述的一种可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8α嵌合受体信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；cMetscFv的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；人CD8α跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；CD137嵌合受体共刺激因子的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；T2A自剪切肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；VH3-3抗体信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；TLR4scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。


4.根据权利要求1所述的一种可自分泌TLR4scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8α嵌合受体信号肽的编码核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；cMetscFv的编码核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；人CD8α跨膜区的编码核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；CD137嵌合受体共刺激因子的编码核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ的编码核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；T2A自剪切肽段的编码核苷酸序列如SEQIDNO.16所...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐奇，朱进，郭娇娇，彭燕，冯振卿，毛圆，常新霞，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32