细胞膜穿透缀合物制造技术

细胞穿透缀合物，包含与功能分子连接的重组β螺旋蛋白，其中所述β螺旋蛋白的长度在5nm至25nm、合适地在10nm至15nm的范围内，并且宽度在1nm至5nm、合适地在1nm至3nm的范围内。还公开制备所述缀合物的方法及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞膜穿透缀合物
本公开广泛地涉及药物向细胞质的递送领域，并且特别地公开了包含与用于穿透细胞膜的功能分子连接的重组蛋白的缀合物，制备所述缀合物的方法及其用途。
技术介绍
细胞膜是将细胞的内部环境与其外部环境分隔开的半透膜。原核和真核细胞的膜虽然在某些性质和组成上有所不同，但都包含磷脂的半渗透性双层结构。细胞膜的半透性使它对能够穿透它的分子类型具有选择性。那些能够穿透细胞膜的分子有望用于细胞标记、细胞渗透、细胞递送、药物吸收、基因治疗以及涉及细胞膜渗透的许多其他应用。有某些肽可以穿透细胞膜并易位到胞质溶胶，这种肽称为细胞穿透肽(CPPs)。已经研究了CPP缀合物，其中CPP连接到一个或多个功能分子上，作为将各种生物活性分子跨膜运输的手段。例如，当使用CPP缀合物CPP-胰岛素处理时，Caco-2细胞中的胰岛素吸收急剧增加(6-8倍)(Liangetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.；2005；335(3):734-738)。对于包含Tat肽的缀合物，观察到相似的结果(同上)。另一项研究报道了使用短两亲性肽载体Pep-1，它可以穿透膜并在几种细胞系中递送各种肽和蛋白质(Morrisetal.,NatureBiotechnol.,2001,1173-1176)。CPP还被用于研究各种抗癌药物作为CPP缀合物的有效传递，由于CPP的特性，CPP缀合物比单独的药物更有效地穿透细胞膜。一项此类研究报道了将Tat蛋白与CK2抑制剂(P15)缀合使用来治疗实体瘤(Pereaetal.,CancerRes.2004,7127-7129)。也有几种分子转运蛋白可以跨细胞膜传递分子。由于胍基的数目和空间排列，已显示包含肽和非肽试剂的富含胍的分子转运蛋白(GR-MoTrs)可以穿透细胞膜。GR-MoTrs可以增强哺乳动物细胞内部各种货物的运输，包括小分子、金属、显像剂、铁颗粒和蛋白质(Wenderetal.,Adv.DrugDeliv.Rev.2008,452-472；Wenderetal.,DrugDiscov.TodayTechnol.2012,e49-e55)。US20130137644公开了由细胞穿透肽、核酸和亲水性聚合物组成的缀合物，所述缀合物可以以增加的效率穿透细胞膜。缀合物中使用的核酸被描述为优选为siRNA，其中聚乙二醇(PEG)为亲水性聚合物。US20040176282公开了用于细胞递送核酸、多肽、荧光团、分子复合物的组合物的方法和用途。复合物的光活化分散刺激细胞渗透后生物活性分子在细胞内的释放。该系统有助于抑制分子的生物学功能，同时又是复合物的一部分，但是一旦进入细胞内部并在光激活后，它就可以分散并恢复其生物学活性。基因疗法是涉及功能分子穿过细胞膜屏障的一种有前途且广泛使用的技术的例子。基因治疗涉及将目的基因传递给细胞，以补偿基因的异常活性或提供有益的蛋白质。基因治疗已被证明可治疗慢性淋巴细胞性白血病、X连锁SCID、多发性骨髓瘤、血友病等疾病。许多威胁生命的疾病具有潜在的遗传起源，即该疾病是由于一种或多种相关基因显示的功能障碍或缺乏适当的功能所致。基因疗法已显示出治疗此类疾病的希望。然而，基因疗法在跨细胞膜递送所需基因方面仍然面临挑战。迄今为止，已经使用了两种传递基因的方法-基于病毒和基于非病毒。用于基因治疗的基于病毒的方法利用减毒病毒作为载体，将所需的基因克隆并通过称为转导的过程转移到所需的细胞中。该方法具有将递送的基因适当整合到细胞基因组中的优点，但是具有其他缺点，其中之一是在不适当的基因组整合的情况下容易诱发癌症。基于非病毒的方法包括将分离的DNA注射到细胞中，以及将阳离子脂质用于质粒DNA的包裹(脂转染)。非病毒方法不需要将基因整合到基因组中，并且在将所需基因转移到组织中的其他细胞方面效率低下。因此，基因疗法虽然是治疗许多危及生命的疾病的有前途的和极好的技术，但它遭受基因传递到细胞中的问题。对于最常见的遗传性疾病，例如囊性纤维化或肌营养不良症，由于难以将遗传物质传递到细胞中，有效的基因治疗可能仍然是一个挑战。尚无一种简单的方法将基因传递到肺上皮或骨骼肌等组织的大量细胞中(Collinsetal.,Proc.R.Soc.B.Vol.282.No.1821.TheRoyalSociety,2015)。因此，需要一种有效的细胞递送机制，该机制可以大大增强基因治疗的益处，并扩大为许多威胁生命的疾病提供有希望的治疗方法的途径。另外，对于所有功能分子向细胞的递送而言，普遍的是，为细胞递送而开发的大多数机制都依赖于依赖内吞作用的机制来进入细胞内。易位效率是依赖于胞吞作用的途径中主要关注的领域，这是由于例如药物被困在内体中或在溶酶体中降解的可能性。因此，迫切需要设计新的穿透细胞膜的机制，该机制可以更加可靠和有效。专利技术概述参考以下描述和所附权利要求将更好地理解本主题的这些和其他特征、方面和优点。提供该概述是为了以简化形式介绍一些概念。本概述既不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。在本公开的第一方面，提供细胞穿透缀合物，包含与功能分子连接的至少一种重组β螺旋蛋白分子，其中所述β螺旋蛋白的长度在5nm至25nm、合适地在10nm-15nm的范围内，并且宽度在1nm至5nm、合适地在1nm-3nm的范围内。在本公开的第二方面，提供一种将功能分子转移到细胞中的方法，该方法包括：(a)将所述功能分子连接到重组β螺旋蛋白以获得缀合物；和(b)使所述细胞穿透缀合物与至少一种细胞接触；其中使缀合物与至少一种细胞接触将核酸分子转移到所述细胞中，并且其中β螺旋蛋白的长度在5nm至25nm、合适地在10nm-15nm的范围内，并且宽度在1nm至5nm、合适地在1nm-3nm的范围内。在第三方面，本公开涉及本专利技术的第一方面的细胞穿透缀合物在用于将功能分子传递到细胞中的用途，其中所述功能分子选自染料、药物、金属、药物金属络合物、蛋白、酶、抗体、核酸、多糖、核定位信号、纳米粒子及其组合。在第四方面，本公开涉及本专利技术的第一方面的细胞穿透缀合物在用于细胞穿透中的用途。在第五方面，本公开涉及本专利技术的第一方面的细胞穿透缀合物在用于细胞标记中的用途。在本公开的第六方面，提供缀合物，包含：(a)至少一种重组β螺旋蛋白；(b)至少一种接头；和(c)至少一种核酸分子，其中至少一种重组β螺旋蛋白的长度在5nm至25nm、合适地在10nm-15nm的范围内，并且宽度在1nm至5nm、合适地在1nm-3nm的范围内。在本公开的第七方面，提供一种将核酸分子转移到细胞中的方法，该方法包括：(i)将所述核酸分子通过至少一种接头连接到至少一种重组β螺旋蛋白以获得缀合物；和(ii)使所述缀合物与至少一种细胞接触，其中使缀合物与至少一种细胞接触将核酸分子转移到所述细胞中，并且其中重组β螺旋蛋白的长度在5nm至25nm、合适地在10nm-15nm的范围内，并且宽度在1nm至5nm、合适地在1n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细胞穿透缀合物，包含与功能分子连接的重组β螺旋蛋白，其中所述β螺旋蛋白的长度在5nm至25nm的范围内，并且宽度在1nm至5nm的范围内。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170823 IN 201731029916;20180124 IN 2018310029451.细胞穿透缀合物，包含与功能分子连接的重组β螺旋蛋白，其中所述β螺旋蛋白的长度在5nm至25nm的范围内，并且宽度在1nm至5nm的范围内。


2.权利要求1所述的缀合物，其中所述β螺旋蛋白的长度在10nm至15nm的范围内，并且宽度在1nm至3nm的范围内。


3.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述β螺旋蛋白包含一个或多个选自下列的氨基酸阶梯结构：精氨酸阶梯、赖氨酸阶梯、天冬酰胺阶梯、天冬氨酸阶梯和谷氨酸阶梯。


4.权利要求3所述的缀合物，其中当存在时，所述精氨酸阶梯包含10至20个精氨酸残基；所述赖氨酸阶梯包含10至30个赖氨酸残基；所述天冬酰胺阶梯包含10至40个天冬酰胺残基；所述天冬氨酸阶梯包含10至40个天冬氨酸残基；并且所述谷氨酸阶梯包含10至40个谷氨酸残基。


5.权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中所述β螺旋蛋白的总电荷小于零。


6.权利要求5所述的缀合物，其中所述β螺旋蛋白的总电荷为-20至-60。


7.权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中所述β螺旋蛋白具有通过原子力显微镜测得的刚度参数K(β螺旋)为0.2至12N/m2的β螺旋结构。


8.权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中所述β螺旋蛋白是五肽重复蛋白。


9.权利要求8所述的缀合物，其中所述β螺旋蛋白包含具有共有序列(STAV)1(DN)2(LF)3(STR)4(G)5的串联重复的五肽。


10.权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中所述β螺旋蛋白由选自以下的序列表示：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12及其组合。


11.权利要求1至10中任一项所述的缀合物，其中所述重组β螺旋蛋白通过选自聚乙二醇(PEG)、肽、金属缀合物、药物金属络合物、DNA结合结构域、核酸嵌入分子及其组合的接头分子与所述功能分子连接。


12.权利要求11所述的缀合物，其中当所述接头分子是肽时，该肽包含选自脂族氨基酸、芳香族氨基酸、及其组合的氨基酸。


13.权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述接头通过共价键、非共价键及其组合与所述重组β螺旋蛋白连接。


14.权利要求1至13中任一项所述的缀合物，其中所述重组β螺旋蛋白通过酯键或酰胺键与功能分子连接。


15.权利要求1至14中任一项所述的缀合物，其中所述功能分子选自染料、药物、金属、药物金属络合物、蛋白、酶、抗体、核酸、多糖、核定位信号、纳米粒子及其组合。


16.权利要求1至15中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物还包含信号序列，其中该信号序列将所述缀合物引导至特定细胞或细胞的一部分。


17.权利要求16所述的缀合物，其中所述信号序列选自SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。


18.权利要求1至17中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物还包含磷脂酰胆碱分子。


19.权利要求16至18中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物将所述功能分子转移至选自以下的位置：细胞器、核、内质网、线粒体、细胞膜、和P-钙黏着蛋白过度表达的乳腺癌细胞。


20.权利要求19所述的缀合物，其中所述细胞器选自肌动蛋白丝、高尔基体、细胞膜、微管蛋白。


21.权利要求1至20中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物用作细胞标记剂。


22.权利要求1至20中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物用于将所述功能分子转移到细胞中。


23.一种将功能分子转移到细胞中的方法，该方法包括：
a)将所述功能分子连接到重组β螺旋蛋白以获得缀合物；
b)使所述缀合物与至少一种细胞接触；
其中步骤(b)中接触缀合物将所述功能分子转移到所述细胞中；并且其中所述β螺旋蛋白的长度在5nm至25nm的范围内，并且宽度在1nm至5nm的范围内。


24.权利要求23所述的方法，其中该方法在步骤(b)之后包括：
c)检测所述细胞内的所述缀合物的转移。


25.权利要求23或24所述的方法，其中所述β螺旋蛋白的长度在10nm至15nm的范围内，并且宽度在1nm至3nm的范围内。


26.权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述β螺旋蛋白包含一个或多个选自下列的氨基酸阶梯结构：精氨酸阶梯、赖氨酸阶梯、天冬酰胺阶梯、天冬氨酸阶梯和谷氨酸阶梯。


27.权利要求26所述的方法，其中当存在时，所述精氨酸阶梯包含10至20个精氨酸残基；所述赖氨酸阶梯包含10至30个赖氨酸残基；所述天冬酰胺阶梯包含10至40个天冬酰胺残基；所述天冬氨酸阶梯包含10至40个天冬氨酸残基；并且所述谷氨酸阶梯包含10至40个谷氨酸残基。


28.权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述β螺旋蛋白的总电荷小于零。


29.权利要求28所述的方法，其中所述β螺旋蛋白的总电荷为-20至-60。


30.权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述β螺旋蛋白具有通过原子力显微镜测得的刚度参数K(β螺旋)为0.2至12N/m2的β螺旋结构。


31.权利要求23至30中任一项所述的方法，其中所述β螺旋蛋白是五肽重复蛋白。


32.权利要求31所述的方法，其中所述β螺旋蛋白包含具有共有序列(STAV)1(DN)2(LF)3(STR)4(G)5的串联重复的五肽。


33.权利要求23至30中任一项所述的方法，其中所述β螺旋蛋白由选自以下的序列表示：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12及其组合。


34.权利要求23至33中任一项所述的方法，其中所述功能分子选自染料、药物、金属、药物金属络合物、蛋白、酶、抗体、核酸、多糖、核定位信号、纳米粒子及其组合。


35.权利要求23至34中任一项所述的方法，其中所述功能分子通过共价键、非共价键及其组合与所述重组β螺旋蛋白连接。


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【专利技术属性】
技术研发人员：N·杰姆桑加米塔，
申请(专利权)人：西卡肿瘤解决方案有限公司，
类型：发明
国别省市：爱尔兰;IE