PE-P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用技术方案

本发明专利技术公开了PE‑P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。所述PE‑P2引导编辑系统包括融合蛋白、pegRNA；所述融合蛋白为依次由Cas9切刻酶或其变体、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶或其变体和反转录酶组成的融合蛋白。本发明专利技术通过自剪切多肽P2A使得PE‑P1系统中的RT、Cas9n(H840A)和HPT三者融合表达，并将sgRNA骨架替换为了esgRNA骨架，得到PE‑P2引导编辑系统。与PE‑P1引导编辑系统相比，本发明专利技术的PE‑P2引导编辑系统不仅可提高编辑靶点的编辑效率，还实现了不可编辑靶点的有效编辑。

【技术实现步骤摘要】
PE-P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及PE-P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。
技术介绍
CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guideRNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNAbreak，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directedrepair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertionsordeletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。2016年和2017年相继报道的胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器虽可以精确的实现胞嘧啶(Cytosine本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.成套系统，其包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；/n所述融合蛋白为依次由Cas9切刻酶或其变体、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶或其变体和反转录酶组成的融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.成套系统，其包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；
所述融合蛋白为依次由Cas9切刻酶或其变体、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶或其变体和反转录酶组成的融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述Cas9切刻酶为Cas9n(H840A)；
和/或，所述Cas9n(H840A)为A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述Cas9n(H840A)的编码基因为a1)或a2)或a3)：
a1)序列1第3013-7113位所示的cDNA分子或DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子。


3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述反转录酶为M-MLVRT；
和/或，所述M-MLVRT为B1)或B2)：
B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
B2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述M-MLVRT的编码基因为b1)或b2)或b3)：
b1)序列1第7213-9243位所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述M-MLVRT的cDNA分子或DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述M-MLVRT的cDNA分子或DNA分子。


4.根据权利要求1-3任一所述的成套系统，其特征在于：所述自切割寡肽为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽；
和/或，所述来源于病毒基因组的2A自切割寡肽为来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽；
和/或，所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的氨基酸序列为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
C2)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的编码基因为c1)或c2)或c3)：
c1)序列5第8674-8730位所示的cDNA分子或DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的cDNA分子或DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的cDNA分子或DNA分子。


5.根据权利要求1-4任一所述的成套系统，其特征在于：所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；
和/或，所述潮霉素磷酸转移酶为D1)或D2)：
D1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
D2)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为d1)或d2)或d3)：
d1)序列1第11665-12690位所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨进孝，徐雯，张成伟，杨永星，康桂婷，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11