用于基因编辑的细胞膜穿透缀合物制造技术

一种用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，其包括与一个或多个基因组编辑系统分子或对一个或多个基因组编辑系统分子进行编码的质粒连接的重组β螺旋蛋白，其中所述β螺旋蛋白的长度在5nm到25nm的范围内，并且宽度在1nm到5nm的范围内。1nm到5nm的范围内。1nm到5nm的范围内。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因编辑的细胞膜穿透缀合物


[0001]本公开广泛地涉及将一种或多种基因编辑分子递送到细胞的细胞质的领域，并且具体地公开了一种包括与用于穿透细胞膜的一种或多种基因编辑分子连接的重组蛋白的缀合物、用于制备所述缀合物的方法以及其用途。本公开还涉及包括与对用于穿透细胞膜的一种或多种基因编辑分子进行编码的核酸或质粒连接的重组蛋白的缀合物、制备所述缀合物的方法以及其用途。

技术介绍

[0002]细胞膜是将细胞的内部环境与其外部环境分开的半渗透膜。原核细胞和真核细胞的膜虽然在一些性质和组成上有所不同，但均包括磷脂的半渗透双层结构。细胞膜的半渗透性质使其对能够穿透其的分子的类型具有选择性。能够穿透细胞膜的那些分子有望用于细胞标记、细胞穿透、细胞递送、药物摄取、基因疗法和涉及细胞膜穿透的许多其它应用。
[0003]存在某些可以穿透细胞膜并易位到细胞质的肽，此类肽被称为细胞穿透肽(CPP)。已对CPP与一个或多个功能分子连接的CPP缀合物进行了研究作为跨膜输送各种生物活性分子的手段。例如，在Caco
‑
2细胞中当用CPP缀合物——CPP胰岛素进行处理时胰岛素的吸收显著增加(6
‑
8倍)(Liang等人,《生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》；2005；335(3):734
‑
738)。包括Tat肽的缀合物看到了类似结果(同上)。另一个研究已经报道了可以穿透膜并且在几种细胞系中递送各种肽和蛋白质的短两亲性肽载体Pep/>‑
1的用途(Morris等人,《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》,2001,1173
‑
1176)。
[0004]CPP还被用于研究作为由于CPP的性质可以比药物单独更有效地穿透细胞膜的药物
‑
CPP缀合物的各种抗癌药物的有效递送。一种此类研究报道了与CK2抑制剂(P15)缀合以对固体瘤进行治疗的Tat蛋白的用途(Perea等人,《癌症研究(Cancer Res.)》2004,7127
‑
7129)。
[0005]还存在可以跨细胞膜递送分子的几种分子转运体。包括肽和非肽药剂的富含胍基的分子转运体(GR
‑
MoTrs)已示出由于胍基的数量和空间阵列而穿透细胞膜。GR
‑
MoTrs可以增强包含小分子、金属、显像剂、铁颗粒和哺乳动物细胞内的蛋白质的各种cargo的递送(Wender等人,《高级药物递送综述(Adv.Drug Deliv.Rev.)》2008,452
‑
472；Wender等人,《今日药物发现：技术(Drug Discov.Today Technol.)》2012,e49
‑
e55)。
[0006]US20130137644公开了一种缀合物，所述缀合物由细胞穿透肽、核酸和亲水聚合物构成，所述缀合物可以以增加的效率穿透细胞膜。所述缀合物中使用的核酸被描述为优选地为以聚乙二醇(PEG)作为亲水聚合物的siRNA。
[0007]US20040176282公开了用于以细胞方式递送核酸、多肽、荧光团、分子复合物的方法以及组合物的用途。细胞穿透之后生物活性分子的细胞内释放受到复合物的光活化分散的刺激。此系统有助于在作为复合物的一部分的同时抑制分子的生物功能，但一旦位于细胞内并在光活化时，分子就会分散并且其生物活性可以恢复。
[0008]另外并且通常对于将所有功能分子递送到细胞而言的是针对细胞递送开发的大多数机制依赖于内吞依赖性机制以进入细胞内部。易位的效率由于例如药物被捕集在内体中或在溶酶体中降解而成为内吞依赖途径中的一个主要关注领域。因此，迫切需要设想出用于穿透细胞膜的可以更可靠且更有效的新颖机制。
[0009]涉及功能分子穿过细胞膜屏障的有前景且广泛使用的技术的一个实例是在活生物体的基因组中对DNA进行编辑(即插入、缺失、修改或替换一个或多个核苷酸)的基因组工程化。
[0010]基因组工程化的一种类型是基因疗法。基因疗法涉及将所关注基因递送到细胞以补偿基因的异常活动或提供有益的蛋白质。基因疗法已被证明有益于治疗如慢性淋巴细胞白血病、X连锁SCID、多发性骨髓瘤、血友病等疾病。许多危及生命的疾病具有潜在的遗传起源，即疾病是由于通过一种或多种相关基因显示出的功能障碍或缺乏适当的功能所致。基因疗法已示出有望治疗此类疾病状况。然而，基因疗法在跨细胞膜递送期望的基因方面仍面临挑战。迄今为止，已经使用了两种递送基因的方法——基于病毒的和基于非病毒的。
[0011]用于基因疗法的基于病毒的方法利用减毒病毒作为载体，在所述减毒病毒中通过被称为转导的过程将期望的基因克隆并转移到需要的细胞中。此方法的优点是将递送的基因适当地整合到细胞的基因组中，但其也有其它缺点，所述缺点之一是在基因组不适当整合的情况下有诱发癌症的趋势。基于非病毒的方法包含使用将分离的DNA注射到细胞中以及使用阳离子脂质来包围质粒DNA(脂质转染)。非病毒方法不需要任何将基因整合到基因组中，并且在将需要的基因转移到组织中的其它细胞方面效率低下。因此，基因疗法虽然是用于治疗许多危及生命的病症的有前途且出色的技术，但存在将基因递送到细胞中的问题。
[0012]对于如囊性纤维化或肌营养不良症等最常见的遗传性疾病，有效的基因疗法可能由于难以将遗传材料输送到细胞中而仍然成为挑战。尚不存在用于将基因递送到组织中的细胞中的相当一部分，如肺上皮或骨骼肌的简单方式(Collins等人,《皇家学会学报B(Proc.R.Soc.B.)》第282期,第1821号。皇家学会(The Royal Society),2015)。因此，需要可以极大地增强基因疗法的益处并扩大用于为许多危及生命的疾病提供有希望的治疗的道路的有效细胞递送机制。
[0013]需要功能分子穿过细胞膜屏障的基因组工程化的另外的类型是基因或基因组编辑。基因组编辑允许在基因组中的期望的位置处通常通过使用经工程化核酸酶创建位点特异性双链断裂。这些断裂然后可以通过非同源端部连接(NHEJ)或同源重组(HR)或同源定向修复(HDR)来修复，从而导致基因组的位点特异性突变或“编辑”。已知的经工程化核酸酶包含锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶归巢核酸内切酶(如ARC nuclease
TM
)或如DNA引导的核酸内切酶和RNA引导的核酸内切酶等核酸引导的核酸内切酶，如主要(但不完全)基于核酸内切酶Cas9的成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统。
[0014]锌指核酸酶(ZFN)是通过在DNA中在用户指定的位置处创建双链断裂来促进基因组的靶向编辑的经工程化DNA结合蛋白。每个锌指核酸酶(ZFN)由两个功能结构域组成：a)包含两指模块链的DNA结合结构域，每个模块识别独特六聚体(6bp)DNA序列。两指模块拼接在一起以形成锌指蛋白，每个模块的特异性≥24bp。b)包含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，所述基因组编辑复合物包括与一个或多个基因组编辑系统分子连接的重组β螺旋蛋白，其中所述β螺旋蛋白的长度在5nm到25nm的范围内，并且宽度在1nm到5nm的范围内。2.一种用于修饰靶多核苷酸的基因组编辑复合物，所述基因组编辑复合物包括与对一个或多个基因组编辑系统分子进行编码的质粒连接的重组β螺旋蛋白，其中所述β螺旋蛋白的长度在5nm到25nm的范围内，并且宽度在1nm到5nm的范围内。3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因组编辑复合物，其中所述一个或多个基因组编辑系统分子选自由以下组成的组：a.RNA引导的核酸内切酶和/或引导RNA(gRNA)；b.锌指核酸酶(ZFN)；c.转录激活因子样效应子核酸酶d.DNA引导的核酸内切酶和/或引导DNA；e.归巢核酸内切酶；f.整合酶。4.根据权利要求3所述的基因组编辑复合物，其中所述一个或多个基因组编辑系统分子是RNA引导的核酸内切酶和/或引导RNA(gRNA)。5.根据权利要求3或权利要求4所述的基因组编辑复合物，其中所述RNA引导的核酸内切酶是Cas9。6.根据权利要求3或权利要求4所述的基因组编辑复合物，其中所述gRNA具有与所述靶多核苷酸中的靶序列互补的序列。7.根据权利要求1到6中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述修饰是添加、缺失或取代所述靶多核苷酸中的一个或多个核苷酸。8.根据权利要求1到7中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述β螺旋蛋白具有大致四边形尖端形状，所述大致四边形尖端形状的长度在5nm到25nm的范围内，并且宽度在1nm到5nm的范围内。9.根据权利要求1到8中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述β螺旋蛋白包括一个或多个氨基酸序列梯结构，所述一个或多个氨基酸序列梯结构选自由以下组成的组：精氨酸序列梯；赖氨酸序列梯；天冬酰胺序列梯；天冬氨酸序列梯；以及谷氨酸序列梯。10.根据权利要求9所述的基因组编辑复合物，其中当存在时，所述精氨酸序列梯包括10到20个精氨酸残基；所述赖氨酸序列梯包括10到30个赖氨酸残基；所述天冬酰胺序列梯包括10到40个天冬酰胺残基；所述天冬氨酸序列梯包括10到40个天冬氨酸残基；并且所述谷氨酸序列梯包括10到40个谷氨酸残基。11.根据权利要求1到10中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述β螺旋蛋白的总电荷小于零。12.根据权利要求11所述的基因组编辑复合物，其中所述β螺旋蛋白的总电荷为
‑
20到
‑
60。13.根据权利要求1到12中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述β螺旋蛋白具有β螺旋结构，所述螺旋结构的硬度参数K(β螺旋)为0.2到12N/m2，如通过原子力显微术测量的。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述β螺旋蛋白是五肽重复序列蛋白。15.根据权利要求14所述的基因组编辑复合物，其中所述β螺旋蛋白包括具有共有序列(STAV)1(DN)2(LF)3(STR)4(G)5的串联重复五肽。16.根据权利要求1到13中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述β螺旋蛋白由选自由以下组成的组的序列表示：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12以及其组合。17.根据权利要求1到16中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述重组β螺旋蛋白通过非共价相互作用与所述一个或多个基因组编辑系统分子或所述质粒连接。18.根据权利要求17所述的基因组编辑复合物，其中所述非共价相互作用选自包括以下的组：氢键合、静电相互作用、范德华相互作用(van der Waal's interactions)、疏水相互作用或其组合。19.根据权利要求1到17中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述重组β螺旋蛋白通过接头分子与所述一个或多个基因组编辑系统分子或所述质粒连接，所述接头分子选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)；乙二胺；肽；金属缀合物、药物
‑
金属缀合物、DNA结合结构域、核酸插层分子以及其组合。20.根据权利要求19所述的基因组编辑复合物，其中当所述接头分子是肽时，所述肽包括氨基酸，所述氨基酸选自由以下组成的组：脂肪族氨基酸；芳香族氨基酸；以及其组合。21.根据权利要求1到20中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述接头通过共价键、非共价键以及其组合与所述重组β螺旋蛋白连接。22.根据权利要求1到21中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述重组β螺旋蛋白通过酯键或酰胺键与所述一个或多个基因组编辑系统分子或所述质粒连接。23.根据权利要求1到22中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述基因组编辑复合物进一步包括信号序列，其中所述信号序列将所述基因组编辑复合物引导到特定细胞或细胞的一部分。24.根据权利要求23所述的基因组编辑复合物，其中所述信号序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。25.根据权利要求1到24中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述基因组编辑复合物进一步包括磷脂酰胆碱分子。26.根据权利要求23到25中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述基因组编辑复合物将所述一个或多个基因组编辑系统分子或所述质粒转移到选自由以下组成的组的位置：细胞器；核；以及P
‑
钙黏蛋白过表达乳腺癌细胞。27.根据权利要求1到26中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述基因组编辑复合物用于基因组编辑。28.一种制备根据权利要求1所述的基因组编辑复合物的方法，所述方法包括将重组β螺旋蛋白与所述一个或多个基因组编辑系统分子组合，其中所述β螺旋蛋白的长度在5nm到25nm的范围内，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：西卡肿瘤解决方案有限公司，
类型：发明
国别省市：