基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5或7所示。还公开了一种核酸分子，编码所述基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子；一种表达载体，包含所述的核酸分子。还公开了所述的基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子、核酸分子、表达载体在降解Tau蛋白中的应用。本发明专利技术开发新型靶向嵌合分子，嵌合分子结合在聚集蛋白Tau的表面，从而将Tau蛋白招募进入细胞自噬小体，促进其通过细胞自噬途径降解。本发明专利技术提供的新的蛋白靶向降解技术，有望将这种新技术应用到不同的目标蛋白上，从而克服当前基于泛素‑蛋白酶体途径的蛋白靶向降解技术不能高效降解胞内大分子组分的缺陷。

【技术实现步骤摘要】
基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子及其应用。
技术介绍
神经退行性疾病是一类以中枢神经元进行性丧失为特征的疾病的总称，因其不可成药性和严重影响中老年患者生活质量而备受关注。其中包括帕金森综合症(PD)、阿尔兹海默症(AD)、亨廷顿舞蹈症(HD)以及肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)。研究表明，大部分神经退行性疾病的发生都伴随着错误折叠蛋白形成的聚集体在神经细胞中的异常积累，从而对神经元产生毒性作用。针对这一类疾病，目前临床上主要是通过小分子抑制剂结合靶蛋白的活性位点，抑制靶蛋白活性，从而缓解神经退行性疾病的症状。然而，单一小分子药物的长期使用会不可避免的会导致耐药性及脱靶效应的产生，且靶蛋白必须要有可供小分子药物结合的活性位点。这就决定了目前仍然有一些疾病具有不可“成药性”。近些年来，在翻译水平通过基于泛素-蛋白酶体途径的PROTACs(ProteinTargetingChimeras)蛋白靶向降解技术实现了对目标蛋白水平的调控。PROTACs是通过将靶蛋白配体与特定的泛素E3连接酶的配体相连形成的双功能嵌合分子。PROTACs蛋白靶向降解嵌合分子能够通过其靶蛋白配体特异性识别靶蛋白，并通过泛素E3连接酶的配体招募E3，从而形成靶蛋白-PROTACs蛋白靶向降解分子-泛素E3连接酶的三元复合体。泛素E3连接酶进一步使靶蛋白被泛素化修饰，最终被26S蛋白酶体识别并被降解。利用PROTACs蛋白靶向降解技术实现了多种致病性蛋白的靶向降解，并且已有相应的药物进入临床试验。然而蛋白酶体只能用于降解一些半衰期短的小分子蛋白，而对于长寿命蛋白、大分子的蛋白质聚集体，则很难通过泛素-蛋白酶体途径得到高效率的清除。因此这也极大地限制了当前的蛋白靶向降解技术在降解胞内大分子组分及神经退行性疾病等研究领域的应用。细胞自噬是真核生物中高度保守的蛋白质降解途径，主要由双层膜结构包裹着待降解的底物(蛋白质聚集体、细胞器、病原菌等)形成自噬小体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，待降解的底物随后在溶酶体酸性水解酶的作用下被降解。自噬小体膜蛋白LC3在自噬小体的形成、成熟以及底物的识别过程中扮演着重要的角色。在细胞水平及小鼠等动物模型中的研究表明，通过药物激活细胞自噬可以降低胞内致病性β-淀粉样蛋白、亨廷顿蛋白(mHTT)以及α-Synuclein蛋白聚集体的水平，从而有效缓解这些蛋白聚集体对神经细胞的毒性。而自噬相关基因的缺失以及细胞自噬被抑制则能够促进蛋白聚集体的形成及其对神经细胞的毒性。这些研究表明，细胞自噬可能成为一个有效的靶点，用于神经退行性疾病的药物研发。通过细胞自噬途径促进胞内大分子组分的特异性降解，将有望为神经退行性疾病的治疗提供新的思路。然而，目前利用细胞自噬途径靶向调控蛋白水平的研究还比较少。微管系统是神经细胞的骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。正常脑组织中Tau蛋白的生物学功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。Tau蛋白为磷酸化修饰蛋白，正常成熟脑组织中Tau蛋白分子含2～3个磷酸化修饰基团。而阿尔茨海默症(老年痴呆症)患者脑组织中的Tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9个磷酸化修饰基团，并丧失正常的生物学功能。阿尔茨海默症患者脑组织中的Tau蛋白总量多于正常人，且正常Tau蛋白减少，异常过度磷酸化的Tau蛋白大量增加。这些异常磷酸化的Tau蛋白在神经细胞中聚集，对神经细胞产生毒性作用而导致神经元功能退化。由于磷酸化的Tau蛋白易形成聚集体，这也导致泛素-蛋白酶体途径很难高效降解Tau蛋白聚集体。因此，开发新的靶向降解策略降解胞内功能异常的Tau蛋白将是治疗阿尔兹海默症最为直接有效的手段之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子及其应用。本专利技术为了实现其目的，采用的技术方案是：一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子，所述嵌合分子的氨基酸序列如SEQIDNO:5或7所示。一种核酸分子，编码上述基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子。进一步，所述核酸分子核苷酸序列为SEQIDNO:16或18所示。一种表达载体，包含上述的核酸分子。一种前述的基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子在降解Tau蛋白中的应用。一种前述的核酸分子在降解Tau蛋白中的应用。一种前述的表达载体在降解Tau蛋白中的应用。p62也称为SQSTM1蛋白，是自噬底物及介导选择性自噬的受体，在肿瘤细胞中发挥自噬与凋亡的作用，其包含4个结构域，分别是PB1，TB，LIR(LC3interactingregion，LC3相互作用序列)，UBA。其中LIR结构域负责与自噬小体膜蛋白Atg8/LC3结合。本专利技术通过基因克隆技术构建基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子。该嵌合分子由Tau蛋白配体TTP(Tautargetingpeptide)与自噬小体膜蛋白LC3相互作用序列LIR共同组成，本专利技术的基于自噬机制介导Tau蛋白降解的原理如图1所示。本专利技术提出的基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子的研究包括如下过程：(1)EGFP-Tau及其相应突变体EGFP-TauP301L表达载体的构建：以XhoI和EcoRI为酶切位点，通过基因克隆技术将Tau和TauP301L蛋白的核酸序列分别连接到pEGFP-C1载体；(2)介导Tau降解的嵌合分子(TTP-LIR)表达载体的构建：通过基因克隆技术，分别以XhoI和HindIII为酶切位点连接Tau蛋白配体的核酸序列，以EcoRI和BamHI为酶切位点连接LIR结构的核酸序列到pHA-C1载体；(3)介导Tau降解的嵌合分子与EGFP-Tau或EGFP-TauP301L在细胞中的共表达：将EGFP-Tau及其相应突变体EGFP-TauP301L的表达载体分别与不同的介导Tau降解的嵌合分子(TTP-LIR)表达载体通过转染试剂共转染HEK293细胞；(4)Westernblot检测目标蛋白EGFP-Tau或EGFP-TauP301L的降解水平：利用EGFP抗体，通过Westernblot技术对靶蛋白EGFP-Tau或EGFP-TauP301L的蛋白水平进行检测，来评价TTP-LIR嵌合分子介导Tau蛋白降解的效率。本专利技术的有益效果是：本专利技术开发新型靶向嵌合分子，嵌合分子在细胞中表达时，能够通过Tau蛋白配体识别Tau蛋白，利用LIR结合在细胞自噬相关蛋白LC3，从而将Tau蛋白招募进入细胞自噬小体，促进其通过细胞自噬途径降解。本专利技术提供了一种新的蛋白靶向降解技术，有望将这种新技术应用到不同的目标蛋白上，从而克服当前基于泛素-蛋白酶体途径的蛋白靶向降解技术不能高效降解胞内大分子组分的缺陷。附图说明<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子，其特征在于：所述嵌合分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或7所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子，其特征在于：所述嵌合分子的氨基酸序列如SEQIDNO:5或7所示。


2.一种核酸分子，其特征在于：编码权利要求1所述基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子。


3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO:16或18所示。

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【专利技术属性】
技术研发人员：杨爱民，梅礼刚，林昌海，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50