本发明专利技术提供了新型抗体(Ab)和片段，其以比Ab尼妥珠单抗更高的亲和力识别人表皮生长因子受体(EGFR)的胞外区，因此可以以更高的效率识别具有中等EGFR表达的细胞系。本发明专利技术还涉及包含所公开的Ab及片段作为活性成分的药用组合物，以及其在治疗具有EGFR表达的肿瘤中的用途。此外，所公开的Ab及片段，当与放射性同位素或荧光团相连接时，在定位具有EGFR的肿瘤中是有用的。另外，当与具有免疫学意义的蛋白质或蛋白质结构域相融合时，所述Ab及片段可以用于将免疫应答导向EGFR阳性肿瘤细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增加的对于表皮生长因子受体的亲和力的抗体及其衍生片段
本专利技术涉及生物技术和医学领域，特别地涉及单克隆抗体(mAb)尼妥珠单抗的变体和衍生自其的抗原结合片段，其在重链可变区的CDR1和CDR2中具有突变并且以更高的亲和力识别人表皮生长因子受体(EGFR)的胞外区；以及其诊断和治疗应用。现有技术EGFR是一种跨膜糖蛋白，其具有与配体相结合的胞外区和有着酪氨酸激酶活性的胞内区。其配体包括：表皮生长因子(EGF)、双调蛋白、转化生长因子、β-动物纤维素(betacellulin)、表皮调节蛋白(epiregulin)和具有肝素结合位点的EGF样生长因子(Olayioye,M.等人,TheEMBOJournal.19:3159-3167,2000；Yarden,Y.和Sliwkowski,M.,NatureReviews.2:127-137,2001)。配体与受体的结合诱导在该受体的胞外区中的构象变化和安排，其引起该受体的二聚化和激活(Ogiso,H.等人,Cell.110:775-787,2002)。该受体牵涉对于上皮细胞的维持和存活做出贡献的各种不同的细胞过程。但是，由于过表达或组成性激活而导致的EGFR/EGF途径的失调促进肿瘤细胞增殖、侵入，并且这与许多恶性肿瘤的差的预后相关联(Yarden,Y.和Sliwkowski,M.,NatureReviews.2:127-137,2001)。由于这样的原因，EGFR被认为是对于开发抗肿瘤疗法来说非常重要的肿瘤相关抗原(Ag)。目前，市场上存在三种特异于EGFR的mAb：西妥昔单抗(Erbitux)、帕尼单抗(Vectibix)和尼妥珠单抗(TheraCIM)(Reichert,J.,mAbs.4:413-415,2012)，而其他七种处于I-III期临床试验中(Reichert,J.和Dhimolea,E.,DrugDiscoveryToday.17:954-963,2012)。它们特别地被设计成用于识别EGFR的胞外区，竞争性地抑制配体的结合和受体的二聚化，这将会抑制导致受体激活的自身磷酸化和信号传导级联(Burgess,A.等人,MolecularCell,12:541-552,2003)。尼妥珠单抗(mAbR3)是识别人EGFR的IgG1同种型的人源化mAb，其通过克隆ioregf/r3小鼠的mAb的高变区以及人来源的重链和轻链的可变区和恒定区的构架(分别REI和NEWN)的DNA来获得(Mateo,C.等人,Immunotechnology.3:71-81,1997)。mAbR3以与其小鼠前驱物相似的亲和力识别EGFR并且具有相同的抑制EGF与受体结合的能力。该变体的免疫原性比嵌合形式的mAbioregf/r3小(Mateo,C.等人,Immunotechnology.3:71-81,1997)。尼妥珠单抗识别在EGFR的胞外区的结构域III中的表位，其与在该结构域中的配体结合位点相叠盖，这解释了其阻断配体结合和随后的受体激活的能力(Tundidor,Y.等人,mAbs.6:1013-1025,2014)。在临床试验中，在具有头颈肿瘤(Crombet,T.等人,JClinOncol22:1646-1654,2004)、神经胶质瘤(Ramos,T.等人.CancerBiolTher.5:375-379,2006；MAbDonald,T.等人,NeuroOncol.13:1049-1058,2011)和食管肿瘤(Ramos-Suzarte,M.等人,CancerBiology&Therapy13:600-605,2012)的患者中已经证明了尼妥珠单抗的功效。该抗体(Ab)处于对于鼻咽癌、局部晚期食管癌和食管鳞状细胞癌的III期临床试验中(Galluzzi,L.等人,OncoImmunology.1:28-37,2012)。与其他针对EGFR的Ab不同，无论在绿长尾猴(Cercopithecusaethiopssabaeus)中的临床前研究中(Arteaga,M.等人,CancerBiology&Therapy.6:1390-1395,2007)，还是在临床研究中(Crombet,T.等人,JClinOncol22:1646-1654,2004；Ramos,T.等人.CancerBiolTher.5:375-379,2006；Ramos-Suzarte,M.等人,CancerBiology&Therapy13:600-605,2012；Strumberg,D.等人,InvestNewDrugs.30:1138-1143,2010)，尼妥珠单抗都未显示出通常与针对该Ag的药物相关联的严重毒性的迹象。这些证据使它成为唯一的可以长期使用的抗-EGFR试剂(Allan,D.,TheOncologist.10:760-761,2005)。该mAb的低毒性特性谱(但具有抗肿瘤效应)可能归因于其中等程度的亲和力(10-8)(Crombet,T.等人,JClinOncol22:1646-1654,2004)。作者预测，具有中等程度的亲和力的mAb应当具有高的抗肿瘤效应和低的毒性，因为有利于Ab被肿瘤组织(EGFR的高表达)结合，超过被正常组织(EGFR的低表达)结合。另一方面，具有高亲和力的mAb(例如西妥昔单抗)可能既被肿瘤细胞也被正常细胞所捕获；和具有低亲和力的mAb由于在肿瘤中的低掺入而可能具有低的效应(Crombet,T.等人,JClinOncol22:1646-1654,2004)。但是，已经描述了，尼妥珠单抗的抗肿瘤效应取决于EGFR的表达，因为在具有该受体的中等或低表达的肿瘤中其功效降低(Akashi,Y.等人,BritishJournalofCancer.98:749-755,2008)。因此，获得具有其对于该受体的亲和力的中等增加的尼妥珠单抗的变体可能转变为具有更大抗肿瘤效应并且保持低毒性的抗体(Ab)。从尼妥珠单抗开始获得该具有中等程度的亲和力的变体，同时保持其精细表位特异性(其在针对EGFR的治疗性Ab中是独特的)(Tundidor,Y.等人,mAbs.6:1013-1025,2014)，将会对于保存原始抗体的有价值的特性做出贡献。Ab的亲和力成熟是以自然形式发生的过程；并且随着组合生物学的发展，已在实验室中再现了该现象。这些定向进化技术需要各种不同的步骤：突变、展示、选择和扩增(Wark,K.和Hudson,P.,AdvancedDrugDeliveryReviews.58:657-670,2006)。噬菌体展示技术提供了用于产生新型人Ab和用于在体外改善其亲和力的强有力的平台(Hoogenboom,H.,NatBiotechnol.23:1105-1116,2005)。本专利技术的专利技术人发现了在噬菌体上展示的尼妥珠单抗的突变型变体，其具有在其结合人EGFR的胞外区的能力方面的增加。所述变体所具有的一整套突变以前未曾描述过，也不是从尼妥珠单抗的Fab的晶体结构的分析开始可预测的。因此，本专利技术的新颖性在于提供了以更高的亲本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.识别人表皮生长因子受体(EGFR)Her1的胞外区的重组单克隆抗体(mAb)，其特征在于，所述重组单克隆抗体相对于抗体尼妥珠单抗而言具有大于95％的同一性，并且/n重链可变区的CDR2的序列选自包括下列各项的组：/n-SEQ ID NO.20，和/n-SEQ ID NO.21，/n在所述重链中CDR1的序列为SEQ ID NO.9且CDR3的序列为SEQ ID NO.3，并且/n轻链可变区的CDR的序列为：/n-CDR1 SEQ ID NO.22，/n-CDR2 SEQ ID NO.23，/n-CDR3 SEQ ID NO.24。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171128 CU 2017-01481.识别人表皮生长因子受体(EGFR)Her1的胞外区的重组单克隆抗体(mAb)，其特征在于，所述重组单克隆抗体相对于抗体尼妥珠单抗而言具有大于95％的同一性，并且
重链可变区的CDR2的序列选自包括下列各项的组：
-SEQIDNO.20，和
-SEQIDNO.21，
在所述重链中CDR1的序列为SEQIDNO.9且CDR3的序列为SEQIDNO.3，并且
轻链可变区的CDR的序列为：
-CDR1SEQIDNO.22，
-CDR2SEQIDNO.23，
-CDR3SEQIDNO.24。
2.识别人EGFRHer1的mAb，其特征在于，重链可变区的CDR2的序列选自包括下列各项的组：
-SEQIDNO.10，
-SEQIDNO.11，
-SEQIDNO.12，
-SEQIDNO.17，
-SEQIDNO.18，和
-SEQIDNO.29，
其中在所述重链中CDR1的序列为SEQIDNO.9且CDR3的序列为SEQIDNO.3，并且
轻链可变区的CDR的序列为：
-CDR1SEQIDNO.22，
-CDR2SEQIDNO.23，
-CDR3SEQIDNO.24。
3.识别人EGFRHer1的mAb，其特征在于，重链可变区的CDR2的序列选自包括下列各项的组：
-SEQIDNO.2，和
-SEQIDNO.8，
在所述重链中CDR1的序列为SEQIDNO.1且CDR3的序列为SEQIDNO.3，并且
轻链可变区的CDR的序列显示在下面：
-CDR1SEQIDNO.22，
-CDR2SEQIDNO.23，
-CDR3SEQIDNO.24。
4.识别人EGFRHer1的mAb，其特征在于，重链可变区的CDR1的序列选自包括下列各项的组：
-SEQIDNO.13，和
-SEQIDNO.19，
其中在所述重链中CDR2的序列为SEQIDNO.14且CDR3的序列为SEQIDNO.3，并且
轻链可变区的CDR的序列为：
-CDR1SEQIDNO.22，
-CDR2SEQIDNO.2...
【专利技术属性】
技术研发人员：Y·通迪多尔卡巴多，G·罗哈斯多兰特斯，K·莱昂蒙松，
申请(专利权)人：分子免疫中心，
类型：发明
国别省市：古巴;CU
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