水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选载体pCALSm2及其应用制造技术

技术编号:24882285 阅读:18 留言:0更新日期:2020-07-14 18:08
本发明专利技术涉及农业生物技术领域,具体涉及水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选载体pCALSm2及其应用。本发明专利技术的水稻ALS突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,本发明专利技术的植物遗传转化筛选载体利用水稻ALS突变基因的表达盒作为筛选标记,在愈伤组织筛选阶段使用嘧啶水杨酸类、咪唑啉酮类等除草剂作为筛选剂,获得的转基因植株具备嘧啶水杨酸类、咪唑啉酮类等除草剂的高抗性。该载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用,在转基因过程中利用植物内源基因,不引入菌源等外源筛选标记基因,不仅丰富了植物转基因筛选方法,还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险,有利于转基因植物商业化应用。

【技术实现步骤摘要】
水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选载体pCALSm2及其应用
本专利技术涉及农业生物
,具体涉及水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选表达盒、含有该表达盒的植物转基因筛选载体及其应用。
技术介绍
随着基因工程和分子生物学技术的迅速发展,转基因技术的应用范围越来越广泛。转基因技术具有诸多的优点,如可拓宽可利用的基因资源,创造新种质资源;可对植物性状进行定向定点变异和选择;为培育高产、优质、高抗优良品种提供新途径等。转基因作物于1996年被批准商业化种植,截至2017年,全球累计批准23种转基因作物进行商业化生产,涉及包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等在内的超过16类目标性状。据统计,2017年全球26个国家和地区种植以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物,面积达1.9亿公顷。转基因作物的大面积推广,为全球农业生产做出了巨大贡献。目前,随着转基因产品的不断推广,人们对转基因产品的态度日趋客观和积极,但对转基因产品的争议仍甚嚣尘上,转基因产品潜在的安全风险问题仍受到普遍关切,因此,转基因产品需要严格的控制和监管。对于转基因作物的争议关键之一是筛选标记可能带来的潜在风险,其转入植物后对靶标生物的抗性、所表达蛋白质的致敏性以及对受体作物本身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响是未知的。目前使用最多的是抗生素类和除草剂类筛选标记,如潮霉素-HPT筛选系统、卡纳霉素-NPTII筛选系统、草丁膦-Bar筛选系统等。这些筛选标记绝大多数为细菌等来源的外源基因,这也是引起公众担忧的原因之一。如果能用植物内源的基因作为筛选标记重新转化植物则可去除外源基因引起的风险和担忧。乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,ALS;EC2.2.1.6)是催化植物体内支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)合成起始步骤的关键酶(Herrera-EstrellaL,BlockMD,MessensE,etal.Chimericgenesasdominantselectablemarkersinplantcells.TheEMBOJournal,1983,2(6):987-995.),是植物特有酶,动物中没有该酶,故可通过抑制ALS酶阻断支链氨基酸的生物合成,进而达到清除植物杂草的目的,而且对人畜无害。目前,已针对该酶研发和应用多种除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰胺类除草剂等。ALS氨基酸序列中某个位点的突变,可使得ALS蛋白结构发生改变,导致ALS抑制剂无法结合ALS,使得ALS对除草剂的敏感性降低,从而对相关除草剂产生抗性(TanS,EvansRR,DahmerML,etal.Imidazolinone-tolerantcrops:history,currentstatusandfuture.PestManagementScience,2005,61(3):246-257;DugglebyRG,McCourtJA,GuddatLW.Structureandmechanismofinhibitionofplantacetohydroxyacidsynthase.PlantPhysiologyandBiochemistry,2008,46(3):309-324;LeeH,RustgiS,KumarN,etal.Singlenucleotidemutationinthebarleyacetohydroxyacidsynthase(AHAS)geneconfersresistancetoimidazolinoneherbicides.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2011,108(21):8909.)。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供水稻ALS突变蛋白及其编码基因;本专利技术的另一目的是为解决目前基因遗传转化中因使用外源筛选标记而导致的潜在安全风险的问题,提供一种利用植物内源基因作为筛选标记应用于植物遗传转化筛选的载体。为实现上述目的,本专利技术的技术方案如下:第一方面,本专利技术提供水稻ALS突变蛋白,所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白在95、548及627位具有氨基酸突变。上述氨基酸位点的组合突变可显著提高ALS蛋白对于ALS抑制剂类除草剂的抗性,进而赋予植物对多种ALS抑制剂类除草剂的高抗性。本专利技术所述的ALS突变蛋白中,95、548及627位氨基酸突变可为将所述植物的野生型ALS蛋白的95、548及627位氨基酸突变为丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸和苏氨酸中的任意一种。优选地,所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白在95位由Gly突变为Ala,在548位由Trp突变为Leu,在627位由Ser突变为Ile。更优选地,所述ALS突变蛋白具有如下(1)或(2)的氨基酸序列:(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列;(2)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的能够使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性的ALS突变蛋白的氨基酸序列。本专利技术提供的水稻ALS突变蛋白对于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类或磺酰胺类除草剂均具有较高的抗性。本专利技术提供编码所述ALS突变蛋白的核酸。所有能够编码所述ALS突变蛋白的核酸序列均在本专利技术的保护范围内,例如:如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术提供包含编码所述ALS突变蛋白的核酸的生物材料,具体可为包含编码所述ALS突变蛋白的核酸的表达盒、载体、宿主细胞或转基因植物细胞系。本专利技术提供所述ALS突变蛋白或编码所述ALS突变蛋白的核酸或含有所述核酸的生物材料的如下任一应用:(1)在使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性或提高植物对ALS抑制剂类除草剂抗性中的应用;(2)在制备转基因植物中的应用;(3)在植物种质资源改良中的应用;(4)在作为植物遗传转化的筛选标记或构建植物遗传转化筛选载体中的应用。本专利技术所述ALS抑制剂类除草剂包括但不限于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类或磺酰胺类除草剂。本专利技术所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生、芝麻、棉花、亚麻子、茵宿、燕麦、油菜籽、大麦、黑麦、小米、烟草、青稞、拟南芥等。优选地,所述植物为水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生或小米。第二方面,本专利技术提供一种植物转基因筛选表达盒,其以植物内源基因作为筛选标记,所述植物内源基因为ALS突变基因。优选地,所述ALS突变基因为水稻ALS突变基因。更优选地,所述水稻ALS突变基因(ALSm2)的编码蛋白为本专利技术所述的ALS突变蛋白。本专利技术发现,序列如SEQIDNO.1所示的ALS突变蛋白更适于作为筛选标记,在植物基因转化过程中能够更高效地发挥筛选标记的功能本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.水稻ALS突变蛋白,其特征在于,所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白在95、548及627位具有氨基酸突变。/n

【技术特征摘要】
1.水稻ALS突变蛋白,其特征在于,所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白在95、548及627位具有氨基酸突变。


2.根据权利要求1所述的ALS突变蛋白,其特征在于,所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白在95位由Gly突变为Ala,在548位由Trp突变为Leu,在627位由Ser突变为Ile;
优选地,所述ALS突变蛋白具有如下(1)或(2)的氨基酸序列:
(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列;
(2)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的能够使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性的ALS突变蛋白的氨基酸序列。


3.一种核酸,其特征在于,其编码权利要求1或2所述的ALS突变蛋白。


4.一种生物材料,其特征在于,其为包含权利要求3所述核酸的表达盒、载体、宿主细胞或转基因植物细胞系。


5.权利要求1或2所述的ALS突变蛋白或权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的生物材料的如下任一应用:
(1)在使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性或提高植物对ALS抑制剂类除草剂抗性中的应用;
(2)在制备转基因植物中的应用;
(3)在植物种质资源改良中的应用;
(4)在作为植物遗传转化的筛选标记或构建植物遗传转化筛选载体中的应用。


6.一种植物转基因筛选表达盒,其特征在于,以植物内源基因作为筛选标记,所述植物内源基因为ALS突变基因;
优选地,所述ALS突变基因为水稻ALS突变基因;
更优选地,所述水稻ALS突变基因的编码蛋白为权利要求1或2所述的ALS突变蛋白。


7.根据权利要求6所述的植物转基因筛选表达盒,其特征在于,所述表达盒还包含用于启动和终止所述ALS突变基因转录的启动子和终止子;
所述启动子为水稻ALS基因启动子,水稻或玉米的U...

【专利技术属性】
技术研发人员:安保光陈思兰欧阳超陈欣妍赵惠敏龙湍吴永忠黄培劲
申请(专利权)人:海南波莲水稻基因科技有限公司
类型:发明
国别省市:海南;46

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