雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用，该雪胆乙酰基转移酶具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明专利技术首次在雪胆中鉴定获得了雪胆甲素合成途径中的关键酶，即，雪胆乙酰基转移酶；该雪胆乙酰基转移酶能够雪胆乙素C‑25位的羟基转化为乙酰基，从而获得雪胆甲素；基于此，本发明专利技术构建了含有雪胆乙酰基转移酶编码基因的重组载体，并进一步构建了基因工程菌，利用转基因工程菌在体外表达雪胆乙酰基转移酶，经进一步对底物雪胆乙素进行催化，直接获得雪胆甲素，无需再通过种植雪胆属植物后提取雪胆甲素；为大量、快速地制备雪胆甲素提供了重要途径。

【技术实现步骤摘要】
雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用
本专利技术属于生物技术
，具体涉及一种雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用。
技术介绍
雪胆(HemsleyachinensisCogn)为葫芦科雪胆属(HewslevaCogn.)植物，在全世界范围内有31种雪胆属植物，除2种产于印度、越南外，其他主要分布于中国云南、四川、贵州等西南地区。已有研究发现，雪胆属植物的块茎中富含葫芦素类和其他三萜皂苷成分，特别是从该属植物中提取的雪胆素(雪胆甲素和雪胆乙素混合物，以雪胆甲素为主)，已经被开发成“雪胆素片”，发挥清热解毒、抗菌消炎等多种功效，临床上常用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎及急性扁桃体炎等多种疾病。此外，国内外学者还发现雪胆甲素(CucurbitacinIIa)具有明显的细胞毒性作用，雪胆甲素能够通过抑制JAK2/STAT3下游的生存素(Survivin)破坏肌动蛋白细胞骨架，引导细胞发生PARP介导的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖，这就使得雪胆甲素成为一类新型的抗癌药物。目前，雪胆甲素主要是从雪胆属植物块茎中提取获得的。近年来，由于人类无序采挖等原因，雪胆类药材的野生资源正在日益减少。为了缓解野生资源的压力，人们逐渐开展雪胆属植物的人工栽培，但雪胆属植物的种植周期长，且对种植地块和种植技术的要求也较高，使得雪胆属植物的人工栽培工作进展得并不顺利。如何去高效地获得这些有用的次生代谢物，一直都是科研究人员思考和研究的问题。对于高附加值的天然产物，采用现代生物技术建立同源或异源表达系统高效生产药用活性成分，已被广泛认为是解决今后药用资源短缺的重要技术手段。但是，要搞清这些活性成分的生物合成途径，必需鉴定这些途径中相关的关键基因，发掘这些催化酶基因成为了研究植物代谢产物生物合成途径的关键环节。学术界普遍认为，雪胆甲素是雪胆乙素C25位上的羟基被乙酰基化而获得的，然而由雪胆乙素获得雪胆甲素的合成路径并不清晰，负责乙酰基化的乙酰基转移酶的功能尚未得到验证，影响了雪胆甲素生物合成工作的推进。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用，该雪胆乙酰基转移酶能够在植物体外将雪胆乙素(CucurbitacinIIb)C-25位的羟基转化为乙酰基，获得雪胆甲素，为大量制备雪胆甲素提供了重要途径。为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术的雪胆乙酰基转移酶具有如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。本专利技术首次在雪胆中鉴定获得了雪胆甲素合成途径中的关键酶：雪胆乙酰基转移酶，该雪胆乙酰基转移酶能够将雪胆乙素C-25位的羟基转化为乙酰基，从而获得雪胆甲素。进一步地，本专利技术首次在雪胆中鉴定获得了雪胆乙酰基转移酶的编码基因，该编码基因具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。为了提高雪胆甲素产量，减少生产雪胆甲素对雪胆属植物的依赖，本专利技术提供了含有上述雪胆乙酰基转移酶的编码基因的重组载体；以及，表达上述的雪胆乙酰基转移酶的转基因工程菌。本专利技术中，雪胆乙酰基转移酶的编码基因在该转基因工程菌内存在的方式有两种，其一：所述的转基因工程菌中包含有上述的含有雪胆乙酰基转移酶的编码基因的重组载体；其二：所述的转基因工程菌的基因组中整合有上述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因。本专利技术还提供了上述的表达雪胆乙酰基转移酶的转基因工程菌在制备雪胆甲素中的应用。作为优选，所述的应用包括：利用所述的转基因工程菌生产雪胆乙酰基转移酶，再利用所述的雪胆乙酰基转移酶制备雪胆甲素。本专利技术还提供了上述的雪胆乙酰基转移酶在制备雪胆甲素中的应用。作为优选，所述的应用包括：以雪胆乙素和乙酰基供体为原料，以所述的雪胆乙酰基转移酶为催化剂，在28-35℃下反应20-40min，获得雪胆甲素。本专利技术能够利用转基因工程菌在体外表达雪胆乙酰基转移酶，经进一步对底物雪胆乙素进行催化，直接获得雪胆甲素，无需再通过种植雪胆属植物后提取雪胆甲素。本专利技术还提供了上述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因在作为雪胆辅助育种分子标记中的应用。鉴于雪胆乙酰基转移酶编码基因是植物合成雪胆甲素的关键基因，因此雪胆乙酰基转移酶编码基因能够作为雪胆的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产雪胆甲素的重要候选基因。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：本专利技术首次在雪胆中鉴定获得了雪胆甲素合成途径中的关键酶：雪胆乙酰基转移酶，该雪胆乙酰基转移酶能够将雪胆乙素C-25位的羟基转化为乙酰基，从而获得雪胆甲素；基于此，本专利技术构建了含有雪胆乙酰基转移酶编码基因的重组载体，并进一步构建了基因工程菌，利用转基因工程菌在体外表达雪胆乙酰基转移酶，经进一步对底物雪胆乙素进行催化，直接获得雪胆甲素，无需再通过种植雪胆属植物后提取雪胆甲素；为大量、快速地制备雪胆甲素提供了重要途径。附图说明图1为本专利技术的雪胆乙酰基转移酶催化雪胆乙素生成雪胆甲素的合成示意图；其中，CucurbitacinIIb表示雪胆乙素，CucurbitacinIIa表示雪胆甲素，HCAT1表示本专利技术的雪胆乙酰基转移酶，下同；图2为含有本专利技术雪胆乙酰基转移酶编码基因的重组质粒pET32a-HCAT1的电泳检测结果图；M表示Marker蛋白标准品，下同；图3为含有本专利技术雪胆乙酰基转移酶编码基因的重组质粒pET32a-HCAT1的结构示意图；图4为本专利技术制备的雪胆乙酰基转移酶HCAT1的蛋白电泳检测结果图；图5为本专利技术制备的雪胆乙酰基转移酶HCAT1的蛋白免疫印迹检测结果图；图6为本专利技术雪胆乙酰基转移酶HCAT1的酶活反应HPLC检测结果图；其中，Control表示空白对照，standard表示标准品；图7为雪胆乙素的特征离子峰图；其中，Mass-to-Charge(m/z)表示质荷比(m/z)，下同；图8为雪胆甲素的特征离子峰图；图9为本专利技术雪胆乙酰基转移酶HCAT1的酶活反应FC-MS检测结果图；其中，Substrate表示反应底物，Product表示反应产物，Retentiontime(min)表示出峰时间(分钟)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案做进一步详细说明。本实施例基于雪胆转录组Unigene基本功能注释信息，在测序注释结果中对BAHD类型乙酰基转移酶(BAHD-AT)候选基因进行筛选，同时，以葫芦科植物中已被鉴定的BAHD-AT基因，主要以黄瓜(Cucumissativus)中鉴定的CsACT、甜瓜(Cucumismelo)中鉴定的CmACT为线索，通过序列本地BLAST分析，然后对筛选结果进行整理分析，最后在雪胆转录组中发现了2个BAHD-AT基因。之后进行cDNA的制备、候选基因的扩增及回收、同源重组、蛋白表达、体外酶活反应，以及HPLC及LC/MS检测等一系列工作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雪胆乙酰基转移酶，其特征在于，具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种雪胆乙酰基转移酶，其特征在于，具有如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因。


3.如权利要求2所述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因，其特征在于，具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。


4.含有如权利要求2或3所述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因的重组载体。


5.表达如权利要求1所述的雪胆乙酰基转移酶的转基因工程菌。


6.如权利要求5所述的表达雪胆乙酰基转移酶的转基因工程菌，其特征在于，包含有如权利要求4所述的含有雪胆乙酰基转移酶的编码基因的重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张广辉，陈庚，杨生超，赵艳，段绍凤，刘冠泽，郭兆宽，林源，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53