一种转氨酶催化剂和一种酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法技术

本发明专利技术涉及医药中间体技术领域，具体涉及一种转氨酶催化剂，还涉及一种酶催化合成(R)‑1‑萘乙胺的方法，其包括以下步骤：向反应容器中加入表达所述转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体和1‑萘乙酮，水浴加热，并机械搅拌；边搅拌边加入有机溶剂或水，氨基供体和磷酸吡哆醛的水溶液；反应结束后，后处理，即得所述(R)‑1‑萘乙胺。本发明专利技术所述的转氨酶催化剂，易于获得，手性选择性高；同时，本发明专利技术所述的酶催化合成(R)‑1‑萘乙胺的方法操作简单，反应条件温和，反应结束稳定，能够直接生成(R)‑1‑萘乙胺，其光学纯度在99％以上，从而避免了繁琐的化学拆分步骤与冗长的化学反应路线。

【技术实现步骤摘要】
一种转氨酶催化剂和一种酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法
本专利技术涉及医药中间体
，具体涉及一种转氨酶催化剂，还涉及一种酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法。
技术介绍
光学纯的(R)-1-萘乙胺是一种重要的医药中间体，其制备方法通常包括：以萘乙酮为原料，加氨水生成亚胺，然后在高温高压条件下加氢得到消旋的萘乙胺，进一步实施化学手性拆分：以手性的天冬氨酸或酒石酸为手性拆分剂，加溶剂加热条件下，形成对映体盐；再利用对映体盐溶解度的不同进行拆分，分离并制备R构型和S构型两种构型的萘乙胺。可见，萘乙胺的拆分过程需用到大量有机试剂，碱性物质，产生大量废水，通常一次性拆分R构型产物ee值可达到98％以上，收率达30％以上。现有工艺中，萘乙胺的合成步骤冗长，例如包含萘乙酮加氨水生成亚胺，高温高压加氢，拆分等步骤。其中，氨水气味大，存在环境污染问题；而高温高压加氢则对设备要求高，存在安全隐患；手性拆分收率不高，从而导致工业生产成本较高。因此，亟需提供一种酶法合成(R)-1-萘乙胺的方法，以期在温和的反应条件下，制得高光学纯度的目标产物。
技术实现思路
针对现有技术中存在的种种技术缺陷，本专利技术旨在提供一种全新的转氨酶催化剂，同时提供一种酶法合成(R)-1-萘乙胺的方法，其操作简单，反应条件温和，反应结束稳定，无需化学拆分，能够直接生成(R)-1-萘乙胺。具体地，本专利技术第一方面提供了一种转氨酶催化剂，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，具体见下表1：表1转氨酶催化剂的核苷酸序列与氨基酸序列同时，本专利技术第二方面提供了一种酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法，其反应方程式为：其中，在磷酸吡哆醛和转氨酶催化剂的存在下，作为反应底物的1-萘乙酮与氨基供体反应生成(R)-1-萘乙胺；其中，所述转氨酶催化剂的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。优选地，上述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法具体包括以下步骤：S1：向反应容器中加入表达所述转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体和1-萘乙酮，水浴加热，并机械搅拌；S2：边搅拌边加入有机溶剂或水，氨基供体和磷酸吡哆醛的水溶液；S3：反应结束后，后处理，即得所述(R)-1-萘乙胺。优选地，上述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法具体包括以下步骤：S1：向反应容器中加入表达所述转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体和1-萘乙酮，水浴加热，并机械搅拌；S2：边搅拌边加入有机溶剂，氨基供体和磷酸吡哆醛的水溶液；S3：反应结束后，减压蒸馏，以去除有机溶剂和过量的氨基供体；S4：过滤，除去重组大肠杆菌湿菌体，后处理，即得所述(R)-1-萘乙胺。此外，值得说明的是，含有所述转氨酶催化剂的酶粉和酶液也可以作为反应的催化剂，相同固含量的酶粉、酶液和重组大肠杆菌湿菌体表现出的催化效果相同。进一步优选地，在上述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中，所述氨基供体选自以下任一种：异丙胺，叔丁胺，苯乙氨。进一步优选地，在上述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中，所述有机溶剂选自以下任一种：乙酸乙酯，乙酸异丙酯，乙酸丁酯，异丙醇，正丁醇，甲基叔丁基醚，甲苯。最优选地，在上述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中，所述有机溶剂为异丙醇，其能提高酶的活性。进一步优选地，在上述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中，所述磷酸吡哆醛的水溶液中磷酸吡哆醛的浓度为1～10mM。进一步优选地，在上述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中，所述后处理包括：取滤液，向其中加入无机酸水溶液，降温结晶，以得到(R)-1-萘乙胺无机酸盐固体；然后加入氢氧化钠，萃取，静置分层，除去溶剂后，即得到(R)-1-萘乙胺。进一步优选地，在上述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中，作为反应底物的所述1-萘乙酮的浓度为100～600g/L，所述氨基供体的浓度为1.8～2.5M，所述重组大肠杆菌湿菌体的浓度为90～180g/L。应当说明的是，上述优选实施方式中各物质的浓度，例如，1-萘乙酮的浓度、氨基供体的浓度、重组大肠杆菌湿菌体的浓度等均是相对于催化体系总体积(例如反应罐的有效容积)而言的，换言之，上述浓度描述的是它们分别相对于催化体系总体积的浓度。进一步优选地，在上述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中，所述重组大肠杆菌湿菌体的制备步骤包括：将目的基因序列委外合成，然后使用分子试剂盒，利用特意的酶切位点连接到大肠杆菌的质粒上，即得到含有目的基因的重组质粒。然后将重组质粒通过电转化转移到大肠杆菌感受态细胞中。电转化步骤如下：感受态细胞从-80℃冰箱取出后，解冻15分钟；15min后，立即在超净台内取40ul的解冻的感受态细胞加到电转杯中，加入1ul质粒；用电转化仪电击转化；电击后立即加入1ml的培养基，轻轻混匀菌体后转移到无菌的BD管中，然后进行摇瓶培养，即得到重组大肠杆菌湿菌体。总之，本专利技术所提供的技术方案与现有技术相比至少具备以下有益效果：本专利技术所述的转氨酶催化剂，易于获得，手性选择性高，能够将1-萘乙酮转化成(R)-1-萘乙胺；同时，本专利技术所述的酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法操作简单，反应条件温和，反应结束稳定，能够直接生成(R)-1-萘乙胺，其光学纯度在99％以上，从而避免了繁琐的化学拆分步骤与冗长的化学反应路线。总之，所述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法十分有利于在大规模工业化生产过程中推广应用。附图说明图1示出了所述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中不同溶剂对应的转化率；图2示出了所述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中不同底物浓度对应的转化率；图3示出了所述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中不同底物浓度对应的产物量；图4示出了所述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中不同底物浓度对应的转化率；图5示出了所述酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法中不同底物浓度对应的产物浓度。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，但不作为本专利技术的限定。根据一个优选实施例的酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法，其反应方程式为：其中，在磷酸吡哆醛和转氨酶催化剂的存在下，作为反应底物的1-萘乙酮与氨基供体反应生成(R)-1-萘乙胺；其中，所述转氨酶催化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转氨酶催化剂，其特征在于，所述转氨酶催化剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种转氨酶催化剂，其特征在于，所述转氨酶催化剂的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法，其特征在于，其反应方程式为：



其中，在磷酸吡哆醛和转氨酶催化剂的存在下，作为反应底物的1-萘乙酮与氨基供体反应生成(R)-1-萘乙胺；
其中，所述转氨酶催化剂的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求2所述的酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：向反应容器中加入表达所述转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体和1-萘乙酮，水浴加热，并机械搅拌；
S2：边搅拌边加入有机溶剂或水，氨基供体和磷酸吡哆醛的水溶液；
S3：反应结束后，后处理，即得所述(R)-1-萘乙胺。


4.根据权利要求2所述的酶催化合成(R)-1-萘乙胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：向反应容器中加入表达所述转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体和1-萘乙酮，水浴加热，并机械搅拌；
S2：边搅拌边加入有机溶剂，氨基供体和磷酸吡哆醛的水溶液；
S...

【专利技术属性】
技术研发人员：李一军，王子坤，黄勇开，王吉勇，马克·博科拉，蔡宝琴，陈海滨，胡虎，余梦娇，刘思彤，
申请(专利权)人：宁波酶赛生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33