本发明专利技术涉及用于提高化妆品成分AA‑2G生产转化率的酶‑环糊精糖基转移酶的制备和应用，所述‑环糊精糖基转移酶氨基酸序列(Geobacillus stearothermophilus,GenBank:CAA41770.1)在第199位、第233位、第240位上发生突变，由原来的N、V、D分别突变为Y、E、A，其有意效果在于，改进的糖基转移酶生产AA‑2G的效率较野生型酶提高8.95‑11.90％。
【技术实现步骤摘要】
用于提高化妆品成分AA-2G生产转化率的酶
本专利技术属于基因工程与酶工程领域，具体涉及AA-2G生产用环糊精糖基转移酶的制备和应用。
技术介绍
维生素C葡萄糖苷(ascorbyglucoside,AA-2G)，学名2-0-α-D吡喃型葡萄糖基-L维生素C(2-0-α-D-glucopyranosy-L-ascorbicacide)是维生素C的一种衍生物，该化合物于1990年由日本林原生物化学研究所与日本冈山大学药学系共同研究发现，AA-2G是VC和吡喃型葡萄糖通过糖基转移酶作用的缩合产物，其中VC的C2羟基被吡喃型葡萄糖苷取代，两者通过糖苷键连接，由于C2上有葡萄糖基，因此AA-2G具有显著的非还原性，其同分易构体5-0-α-D吡喃型葡萄糖基-L维生素C(AA-5G)和6-0-α-D吡喃型葡萄糖基-L维生素C(AA-6G)都具有直接的还原性，虽然其比VC稳定，但不如AA-2G稳定。AA-2G具有非还原活性，不易发生氧化反应，在水溶液中稳定，具有较好的耐光型和耐热性，进入细胞后经α-葡萄糖苷酶水解生成VC和葡萄糖，具有同原始VC一样的还原性和抗氧化性，以及促进胶原蛋白的形成。环糊精糖基转移酶(CGTase)属于糖基水解酶家族，被认为是催化合成AA-2G的最佳酶，CGTase能够催化4种反应：水解反应、环化反应、耦合反应以及歧化反应，CGTase通过歧化作用可以催化低聚糖和VC反应生成葡萄糖基维生素C。日本林原生化和冈山大学首次以α-环糊精作为糖基供体通过生物转化法合成AA-2G，AA-2G的纯度可达97％，目前酶法合成是AA-2G合成的唯一途径。已经开发的用于合成AA-2G的酶有5种，α-葡萄糖苷酶、环糊精葡萄糖苷转移酶、α-淀粉酶、蔗糖磷酸酶、α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，目前投入工业化生产的是环糊精葡萄糖苷转移酶，也是目前催化合成AA-2G的最佳酶，但是现有技术中CGTase还存在酶的转化率不高的问题。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供用于提高化妆品成分AA-2G生产转化率的酶，其具有更高的转化率，更适合AA-2G的生产。本专利技术的制备过程如下：1.从NCBI上获得环糊精糖基转移酶序列(Geobacillusstearothermophilus,GenBank:CAA41770.1)，交生物公司合成，采用EcoRⅠ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GTGCGGCCGCAAGCTTTGATGCCTTGACACTGAGT，R:CTCCGTCGACAAGCTAAGCAGCCATAGCGTCATCA，PCR反应结束后，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用HindⅢ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coliBL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；2.质粒DNA的提取将携带有质粒pET20b(+)/cgt的E.coliBL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；3.易错PCR扩增与突变文库的构建以步骤b获得的质粒为模板，用EcoRⅠ酶切使质粒线性化，设计引物cgt-F：GACGGAGCTCGAATTTTGATGCCTTGACACTGAGT和cgt-R：ATTCGGATCCGAATTAAGCAGCCATAGCGTCATCA，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRaTaqBuffer，dNTPsMixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA200ng，TaqDNA聚合酶2.5U，PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min，Mn2+浓度0.5mmol/l，Mg2+浓度为7.0mmol/l，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliBL21，涂布于固体LB平板(100μg/mlAmp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库；4.突变文库的高通量筛选从LB平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有300μlLB培养基(内含50μg/mlAmp)的96孔中，每孔对应一特定转化子，每块96孔板同时接种野生型克隆，作为阳性对照，37℃、200r/min振荡培养12h，在无菌条件下，从96孔板中取出20μl菌液，对应接入含1000μl乳糖自诱导培养基的另一96深孔板中，并进行37℃、200r/min振荡培养，4℃临时冷藏种子于96深孔板，25℃、200r/min振荡培养重组菌48h后，以每孔一一对应为原则，移取10μl上清粗酶液至第2块已加入每孔90μl淀粉底物[5％(W/V)]的96孔PCR反应板中，60℃条件下反应10min，加入100μl1mol/l的盐酸，加入100μl甲基橙显色液，于酶标仪上测定OD505并保存数据，计算每个克隆子酶活，以阳性对照为参考，将结果高于阳性对照的克隆挑出并进行复筛；5.将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序；6.突变体的生产，将步骤五的含有突变质粒的E.coliBL21发酵培养；7.突变体的纯化，采用分子筛的方法纯化突变体；8.对突变体进行SDS-PAGE电泳；9.采用Bradford测定蛋白质浓度。本专利技术的有益效果是：获得了三种用于提高化妆品成分AA-2G生产转化率的酶，其具有更高的转化率，更适合AA-2G的生产。附图说明图1SDS-PAGE电泳图图2野生型CTG酶及突变位点三维图图3CGT酶最适反应温度具体实施方式下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本专利技术，并不限制本专利技术的范围。实施例1本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；表1实验材料和试剂表2实验仪器设备AB104-N电子分析天平梅特勒-托利多上海有限公司PTC-200型PCR仪美国MJResearch公司DYY-6D型核酸电泳仪北京市六一仪器厂MiniProtein3蛋白电泳系统美国Bio-Rad公司<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于提高化妆品成分AA-2G生产转化率的酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(Geobacillus stearothermophilus,GenBank:CAA41770.1)在第199位、第233位、第240位上发生突变，由原来的N、V、D分别突变为Y、E、A，构建方法包括以下步骤：/na.从NCBI上获得环糊精糖基转移酶序列(Geobacillus stearothermophilus,GenBank:CAA41770.1)，交生物公司合成，采用HindⅢ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GTGCGGCCGCAAGCTTTGATGCCTTGACACTGAGT，R:CTCCGTCGACAAGCTAAGCAGCCATAGCGTCATCA，PCR反应结束后，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用HindⅢ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；/nb.质粒DNA的提取/n将携带有质粒pET20b(+)/cgt的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；/nc.易错PCR扩增与突变文库的构建/n以步骤b获得的质粒为模板，用EcoRⅠ酶切使质粒线性化，设计引物cgt-F：GACGGAGCTCGAATTTTGATGCCTTGACACTGAGT和cgt-R：ATTCGGATCCGAATTAAGCAGCCATAGCGTCATCA，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min，Mn...
【技术特征摘要】
1.用于提高化妆品成分AA-2G生产转化率的酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(Geobacillusstearothermophilus,GenBank:CAA41770.1)在第199位、第233位、第240位上发生突变，由原来的N、V、D分别突变为Y、E、A，构建方法包括以下步骤：
a.从NCBI上获得环糊精糖基转移酶序列(Geobacillusstearothermophilus,GenBank:CAA41770.1)，交生物公司合成，采用HindⅢ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GTGCGGCCGCAAGCTTTGATGCCTTGACACTGAGT，R:CTCCGTCGACAAGCTAAGCAGCCATAGCGTCATCA，PCR反应结束后，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用HindⅢ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coliBL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
b.质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/cgt的E.coliBL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
c.易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤b获得的质粒为模板，用EcoRⅠ酶切使质粒线性化，设计引物cgt-F：GACGGAGCTCGAATTTTGATGCCTTGACACTGAGT和cgt-R：ATTCGGATCCGAATTAAGCAGCCATAGCGTCATCA，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRaTaqBuffer，dNTPsMixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA200...
【专利技术属性】
技术研发人员：范泽浩，
申请(专利权)人：广州古泉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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