工程化的葡糖基转移酶制造技术

本文公开了具有经修饰的氨基酸序列的葡糖基转移酶。例如，这类工程化的酶表现出增加的α‑葡聚糖产品产率和/或降低的明串珠菌二糖产率。进一步公开了使用工程化的葡糖基转移酶产生α‑葡聚糖的反应和方法。

Engineering glucosyltransferase

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化的葡糖基转移酶本申请要求美国临时申请号62/557,840(2017年9月13日提交)的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。
本公开属于酶催化领域。例如，本公开涉及具有经修饰的氨基酸序列的葡糖基转移酶。例如，此类经修饰的酶具有改进的产品产率特性。以电子方式提交的序列表的引用所述序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20180911_CL6613WOPCT_SequenceListing_ST25，创建于2018年9月11日，且具有约406千字节的大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
技术介绍
受到在多种应用中使用多糖的期望所驱动，研究人员已经探索了可生物降解的、并且可以从可再生来源的原料节约地制造的多糖。一种这样的多糖是α-1，3-葡聚糖，这种多糖是特征在于具有α-1，3-糖苷键的不溶性葡聚糖聚合物。例如，已经使用从唾液链球菌(Streptococcussalivarius)分离的葡糖基转移酶制备了这种聚合物(Simpson等人，Microbiology[微生物学]141：1451-1460，1995)。还例如，美国专利号7000000公开了从酶促生产的α-1，3-葡聚糖制备纺成纤维。还研究了用于开发新应用或增强的应用的多种其他葡聚糖材料。例如，美国专利申请公开号2015/0232819公开了具有混合的α-1，3键和α-1，6键的若干种不溶性葡聚糖的酶促合成。虽然已经在使用葡糖基转移酶生产葡聚糖聚合物方面取得了这些进展和其他进展，但似乎很少关注这类酶的葡聚糖产率的改进。为解决这一技术差距，本文公开了被工程化以具有经修饰的氨基酸序列的葡糖基转移酶，这些经修饰的氨基酸序列赋予这些酶增强的葡聚糖生产特性。
技术实现思路
在一个实施例中，本公开涉及在与SEQIDNO：62的氨基酸残基Gln-588、Phe-607或Arg-741相对应的位置处包含至少两个氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶，其中所述非天然葡糖基转移酶合成包含1，3-键的α-葡聚糖，并且其中所述非天然葡糖基转移酶具有：(i)比第二葡糖基转移酶的α-葡聚糖产率更高的α-葡聚糖产率，所述第二葡糖基转移酶仅在取代位置处与非天然葡糖基转移酶不同，和/或(ii)比第二葡糖基转移酶的明串珠菌二糖产率更低的明串珠菌二糖产率。在另一个实施例中，本公开涉及包含编码如目前公开的非天然葡糖基转移酶的核苷酸序列的多核苷酸，任选地其中一个或多个调节序列可操作地连接到所述核苷酸序列，并且优选地其中所述一个或多个调节序列包含启动子序列。在另一个实施例中，本公开涉及反应组合物，所述反应组合物包含水、蔗糖和如目前公开的非天然葡糖基转移酶。在另一个实施例中，本公开涉及产生α-葡聚糖的方法，所述方法包括：(a)使至少水、蔗糖和如目前公开的非天然葡糖基转移酶接触，从而产生α-葡聚糖；和b)任选地，分离在步骤(a)中产生的α-葡聚糖。在另一个实施例中，本公开涉及制备编码非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)鉴定编码亲本葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述亲本葡糖基转移酶(i)包含与SEQIDNO：4或SEQIDNO：4的位置55-960具有至少约40％同一性的氨基酸序列，并且(ii)合成包含1，3-键的α-葡聚糖；和(b)修饰在步骤(a)中鉴定的多核苷酸序列以在与SEQIDNO：62的氨基酸残基Gln-588、Phe-607或Arg-741相对应的位置处取代亲本葡糖基转移酶的至少两个氨基酸，从而提供编码非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述非天然葡糖基转移酶具有：(i)比亲本葡糖基转移酶的α-葡聚糖产率更高的α-葡聚糖产率，和/或(ii)比亲本葡糖基转移酶的明串珠菌二糖产率更低的明串珠菌二糖产率。序列简述表1.核酸和蛋白质SEQID号的汇总ba将该DNA编码序列进行密码子优化用于在大肠杆菌(E.coli)中表达，并且仅公开为合适编码序列的实例。bSEQIDNO：21-24、31、32、35-58和66有意不包括在本表中，并且仅作为占位符。具体实施方式所有引用的专利和非专利文献的公开内容通过引用以其全文并入本文。除非另外公开，否则如本文所使用的术语“一个/一种”旨在涵盖一个/一种或多个/多种(即至少一个/一种)所引用的特征。如果存在，所有范围是包含性的和可组合的，除非另有说明。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等范围。术语“α-葡聚糖”、“α-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-葡聚糖是包含通过α-糖苷键连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物。在典型的实施例中，本文中的α-葡聚糖包含至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的α-糖苷键。本文中的α-葡聚糖聚合物的实例包括α-1，3-葡聚糖。术语“聚α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-1，3-葡聚糖是包含通过糖苷键连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物，典型地其中至少约50％的糖苷键是α-1，3糖苷键。在某些实施例中，α-1，3-葡聚糖包含至少90％或95％的α-1，3糖苷键。本文中α-1，3-葡聚糖中的大部分键或全部其他键典型地是α-1，6，尽管一些键还可以是α-1，2和/或α-1，4。术语“糖苷键(glycosidiclinkage和glycosidicbond)”、“键(linkage)”等在本文中可互换地使用，并且是指将碳水化合物(糖)分子连接到另一基团(例如另一种碳水化合物)的共价键。如本文所使用的术语“α-1，3-糖苷键”是指通过相邻的α-D-葡萄糖环上的碳1和3将α-D-葡萄糖分子彼此连接的共价键的类型。如本文所使用的术语“α-1，6-糖苷键”是指通过相邻α-D-葡萄糖环上的碳1和6将α-D-葡萄糖分子彼此连接的共价键。本文中的葡聚糖聚合物的糖苷键(glycosidiclinkage)也可以称为“糖苷键(glucosidiclinkage)”。本文中，“α-D-葡萄糖”将被称为“葡萄糖”。本文中α-葡聚糖的糖苷键谱图可以使用本领域已知的任何方法确定。例如，可以使用采用核磁共振(NMR)波谱法(例如，13CNMR或1HNMR)的方法确定键谱图。可以使用的这些和其他方法公开于例如，FoodCarbohydrates：Chemistry，PhysicalProperties，andApplications[食品碳水化合物：化学、物理特性和应用](S.W.Cui编辑，第3章，S.W.Cui，Structura本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非天然葡糖基转移酶，所述非天然葡糖基转移酶在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Gln-588、Phe-607、或Arg-741相对应的位置处包含至少两个氨基酸取代，/n其中所述非天然葡糖基转移酶合成包含1，3-键的α-葡聚糖，并且/n其中所述非天然葡糖基转移酶具有：/n(i)比第二葡糖基转移酶的α-葡聚糖产率更高的α-葡聚糖产率，所述第二葡糖基转移酶仅在取代位置处与所述非天然葡糖基转移酶不同，和/或/n(ii)比所述第二葡糖基转移酶的明串珠菌二糖产率更低的明串珠菌二糖产率。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170913 US 62/5578401.一种非天然葡糖基转移酶，所述非天然葡糖基转移酶在与SEQIDNO：62的氨基酸残基Gln-588、Phe-607、或Arg-741相对应的位置处包含至少两个氨基酸取代，
其中所述非天然葡糖基转移酶合成包含1，3-键的α-葡聚糖，并且
其中所述非天然葡糖基转移酶具有：
(i)比第二葡糖基转移酶的α-葡聚糖产率更高的α-葡聚糖产率，所述第二葡糖基转移酶仅在取代位置处与所述非天然葡糖基转移酶不同，和/或
(ii)比所述第二葡糖基转移酶的明串珠菌二糖产率更低的明串珠菌二糖产率。


2.权利要求1的非天然葡糖基转移酶，其中所述葡糖基转移酶在与SEQIDNO：62的氨基酸残基Gln-588、Phe-607、或Arg-741相对应的位置处包含氨基酸取代。


3.权利要求1的非天然葡糖基转移酶，其中：
(i)在与氨基酸残基Gln-588相对应的位置处的氨基酸被Leu、Ala、或Val残基取代；
(ii)在与氨基酸残基Phe-607相对应的位置处的氨基酸被Trp、Tyr或Asn残基取代；和/或
(iii)在与氨基酸残基Arg-741相对应的位置处的氨基酸被Ser或Thr残基取代。


4.权利要求1的非天然葡糖基转移酶，其中所述葡糖基转移酶在与SEQIDNO：62的氨基酸残基Ala-510和/或Asp-948相对应的位置处进一步包含至少一个氨基酸取代；
任选地，其中：
(i)在与氨基酸残基Ala-510相对应的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Ile、或Val残基取代；和/或
(ii)在与氨基酸残基Asp-948相对应的位置处的氨基酸被Gly、Val、或Ala残基取代。


5.权利要求1的非天然葡糖基转移酶，其中所述葡糖基转移酶在与SEQIDNO：62的氨基酸残基Ser-631、Ser-710、Arg-722、和/或Thr-877相对应的位置处进一步包含至少一个氨基酸取代；
任选地，其中：
(i)在与氨基酸残基Ser-631相对应的位置处的氨基酸被Thr、Asp、Glu或Arg残基取代；
(ii)在与氨基酸残基Ser-710相对应的位置处的氨基酸被Gly、Ala、或Val残基取代；
(iii)在与氨基酸残基Arg-722相对应的位置处的氨基酸被His或Lys残基取代；和/或
(iv)在与氨基酸残基Thr-877相对应的位置处的氨基酸被Lys、His、或Arg残基取代。


6.权利要求1的非天然葡糖基转移酶，其中所述葡糖基转移酶在与SEQIDNO：62的氨基酸残基Val-1188、Met-1253、和/或Gln-957相对应的位置处进一步包含至少一个氨基酸取代；
任选地，其中：
(i)在与氨基酸残基Val-1188相对应的位置处的氨基酸被Glu或Asp残基取代；
(ii)在与氨基酸残基Met-1253相对应的位置处的氨基酸被Ile、Leu、Ala、或Val残基取代；和/或
(iii)在与氨基酸残基Gln-957相对应的位置处的氨基酸被Pro残基取代。

【专利技术属性】
技术研发人员：李友根，ED赛穆克，程琼，赖建平，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：美国;US