油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用。更具体地，本发明专利技术提供了耐受三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的油菜植物及其部分、抗性基因、突变蛋白及其应用。

Three herbicides and their application in rape

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用
本专利技术涉及植物基因工程
，具体地，涉及油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用。更具体地，本专利技术涉及耐受三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的油菜植物及其部分、抗性基因、突变蛋白及其应用。
技术介绍
油菜是我国播种面积最大，地区分布最广的油料作物。我国是世界上生产油菜籽最多的国家。油菜生产过程中一类重要的生物危害是农田杂草，其不但与油菜作物争水争肥争光，而且改变油菜作物田间小气候，甚至有些杂草还是油菜作物病虫害的中间寄主，加快病虫害的蔓延，严重影响了油菜作物产量和品质。然而，人工除草费时、费力，增加生产成本。因此，应用除草剂防治田间杂草成为人们的必然选择。除草剂主要是通过抑制或干扰植物关键的代谢过程而抑制植物生长或杀死植物。以氨基酸生物合成过程中的关键酶为靶标，是研发新型高效除草剂的一个重要方向和热点。以乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS；EC2.2..16)为靶酶开发的除草剂，己经成为新型高效除草剂的主流产品。ALS是催化支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成第一步的酶。ALS抑制剂类除草剂能抑制植物细胞内的ALS酶活性，阻碍支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成，从而抑制植物细胞的分裂和生长。已研制开发的乙酰乳酸合酶抑制剂主要有磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、三唑嘧啶磺酰胺类(triazolopyrimidines，TP)等除草剂。在众多的乙酰乳酸合酶抑制剂中，三唑嘧啶磺酰胺类除草剂自20世纪90年代开发成功以来发展非常迅速，已报道了近10个商品化的品种，主要有双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、双氯磺草胺、五氟磺草胺等。三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的作用机制与磺酰脲类除草剂类似，是典型的乙酰乳酸合酶抑制剂。三唑嘧啶磺酰胺类除草剂使植物体内ALS活力降低，缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的合成受到抑制，影响蛋白质的合成从而导致植物生长停止而死亡。植物根与叶均吸收药剂，在体内周身传导，积累于分生组织，抑制细胞分裂。杂草受害的典型症状是：叶片中脉失绿，叶脉褪色，叶片白化或紫化，节间变短，顶芽死亡，最终全株死亡而起到杀死杂草的目的。研究发现，ALS上氨基酸替换发生的位点及其位点处替换氨基酸不同产生的抗性功能存在显著差异(Yu Q,Han HP,Martin M,Vila-Aiub,Powles SB.AHAS herbicide resistance endowing mutations:effect on AHAS functionality and plant growth.J Exp Botany,2010,61:3925-3934)。不同位点氨基酸替换产生的ALS抑制剂除草剂抗性效应存在显著差异，同时不同位点突变对其它ALS抑制剂除草剂存在比较复杂的交互抗性关系。本领域需要获得相对于强生命力的杂草具有生长优势的油菜植物，需要获得可耐受三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的非转基因油菜植物。专利技术概述本专利技术解决了这种需要，并提供了突变的乙酰乳酸合酶(ALS)核酸和这些突变的核酸编码的蛋白。本专利技术还涉及包含这些突变核酸和蛋白的油菜植物、细胞和种子，所述突变赋予油菜植物对于三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的耐受，其中所述ALS基因编码的ALS多肽在其位置556处含有不同于色氨酸的氨基酸并且在其位置179处含有不同于脯氨酸的氨基酸。在优选的实施方式中，所述ALS基因编码的ALS多肽具有选自下列的双重突变：W556L和P179S；W556L和P179T；W556L和P179L；W556L和P179A。在最优选的实施方式中，所述ALS基因编码的ALS多肽具有下列突变：W556L和P179S。在一个实施方式中，本专利技术提供了编码突变的乙酰乳酸合酶(ALS3)的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶(ALS3)蛋白包含如下的突变：在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；优选地，所述的分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；优选地，其中所述突变的ALS3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。在一个方面，本专利技术提供了表达盒、载体或细胞，其含有本专利技术所述的核酸。相应地，本专利技术提供了本专利技术的核酸、表达盒、载体或细胞或突变的乙酰乳酸合酶(ALS3)蛋白用于产生抗除草剂植物的用途，优选地，所述植物为油菜。在另一个方面，本专利技术提供了产生具有除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：将本专利技术所述的核酸导入植物，优选地通过转基因、杂交、回交或无性繁殖等步骤将本专利技术所述的核酸导入植物，其中所述植物表达本专利技术所述的突变的乙酰乳酸合酶(ALS3)蛋白并具有三唑嘧啶磺酰胺类除草剂抗性。在又一个方面，本专利技术提供了抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的非转基因植物或其部分，其包含编码突变的乙酰乳酸合酶蛋白的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含如下的突变：在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)，优选地，其中所述植物是油菜；其中所述部分为植物的器官、组织和细胞，并且优选种子；优选地，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)和在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)；更优选地，其中所述突变的ALS3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。在另一个方面，本专利技术提供了在含有油菜植物的田地中控制杂草的方法，所述方法包括施用有效量的三唑嘧啶磺酰胺类除草剂至含有所述杂草和油菜植物的所述田地，所述油菜植物包含编码突变的乙酰乳酸合酶蛋白的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含如下的突变：在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；优选地，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)和在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)；更优选地，其中所述突变的ALS3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。附图说明图1显示了不同来源的油菜ALS3氨基酸部分序列比对结果。ALS3，Genbank上参考序列(登录号：Z11526)；ALS3_N131野生型品系N131的ALS3氨基酸部分序列；ALS3_EM28抗性材料EM28的ALS本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码突变的乙酰乳酸合酶蛋白的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含如下的突变：/n在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和/n在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；/n优选地，所述的分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；/n优选地，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】编码突变的乙酰乳酸合酶蛋白的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含如下的突变：
在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和
在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；
优选地，所述的分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
优选地，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。


表达盒、载体或细胞，其包含权利要求1所述的核酸。


突变的乙酰乳酸合酶蛋白，其包含如下的突变：
在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和
在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；
优选地，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)和在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)；
更优选地，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。


权利要求1所述的核酸或权利要求2所述的表达盒、载体或细胞或权利要求3所述的突变的乙酰乳酸合酶蛋白用于产生抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂植物的用途，优选地，所述植物为油菜。


产生具有三唑嘧啶磺酰胺类除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的核酸导入植物，优选地通过转基因、杂交、回交或无性繁殖等步骤将权利要求1所述的核酸导入植物，其中所述植物表达权利要求3所述的突变的乙酰乳酸合...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡茂龙，浦惠明，龙卫华，高建芹，张洁夫，陈松，程丽，彭琦，陈锋，周晓婴，张维，付三雄，王晓东，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32