一种海藻糖合成酶突变体及其在海藻糖生产中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种海藻糖合成酶突变体及其在海藻糖生产中的应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术海藻糖合成酶的酶活较高，将携带本发明专利技术海藻糖合成酶的大肠杆菌诱导培养12h，即可使粗酶液中海藻糖合成酶的比酶活高达35.2U/mg，将携带本发明专利技术海藻糖合成酶的谷氨酸棒杆菌诱导培养12h，即可使粗酶液中海藻糖合成酶的比酶活高达33.5U/mg；本发明专利技术海藻糖合成酶突变体的比酶活与海藻糖转化率均较野生型海藻糖合成酶有了较为明显的提高，其中，海藻糖合成酶突变体K246A的比酶活较野生型酶提高了1.43倍，海藻糖转化率较野生型酶提高了约15％。

【技术实现步骤摘要】
一种海藻糖合成酶突变体及其在海藻糖生产中的应用
本专利技术涉及一种海藻糖合成酶突变体及其在海藻糖生产中的应用，属于酶工程

技术介绍
海藻糖(Trehalose)是一种自然界中广泛存在的二糖，由两个葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，最初被Wiggers从黑麦麦角菌中分离出来，广泛存在于细菌、真菌、酵母、低等蕨类植物、藻类、昆虫以及无脊椎动物中。海藻糖在生物体内除作为结构成分以及提供能量以外，最重要的作用是作为一种典型的应激代谢物，在干燥、低温、高渗等许多环境条件下保护生物体细胞内的蛋白质、脂类、糖类、核酸等组分不受破坏，进而保护细胞免受伤害，因此，海藻糖已成为疫苗、酶、活体组织和细胞的生物活性保存的重要保护剂；同时，海藻糖对酸和热具有高度稳定性，可防止淀粉老化和蛋白质变性，可抑制脂肪酸败，具有矫味矫臭功能，具有高玻璃化转变温度、低吸湿性、低甜度，这些特性均使它在食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业得到广泛应用，成为上万种产品的添加剂。可以说，海藻糖已成为世界上最重要的低聚糖资源之一。海藻糖有多种生产方法，包括直接提取法、发酵法、基因重组法、化学合成法和酶转化法。其中，酶转化法由于具有转化率高、专一性强、作用温和、无污染等优点，被认为是最有发展潜力的工业生产方法。目前，酶转化法使用的酶主要有三种，包括海藻糖磷酸化酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶以及海藻糖合成酶。其中，海藻糖磷酸化酶需消耗价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖，在生产成本上很难有竞争优势；麦芽寡糖基海藻糖合成酶和海藻糖合成酶可分别以淀粉的水解产物麦芽糊精和者麦芽糖为底物生产海藻糖，具有较强的竞争优势。然而，使用麦芽寡糖基海藻糖合成酶生产海藻糖最终会积累大量的麦芽三糖等低聚糖，进而对海藻糖纯度造成影响；海藻糖合成酶则由于酶活和海藻糖转化率较低难以进行大规模工业生产。因此，急需找到酶活和海藻糖转化率高的海藻糖合成酶以解决其难以进行大规模工业生产的问题。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提高海藻糖合成酶的酶活和海藻糖的产量。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了一种海藻糖合成酶，所述海藻糖合成酶的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述海藻糖合成酶来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces_coelicolorm)。本专利技术还提供了一种海藻糖合成酶突变体，所述突变体是通过将上述海藻糖合成酶的第246位赖氨酸和/或第165位丙氨酸和/或第178位苯丙氨酸进行突变得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是通过将上述海藻糖合成酶的第246位赖氨酸突变为丙氨酸得到的，此突变体命名为K246A；或所述突变体是通过将上述海藻糖合成酶的第165位丙氨酸突变为苏氨酸得到的，此突变体命名为A165T；或所述突变体是通过将上述海藻糖合成酶的第178位苯丙氨酸突变为酪氨酸得到的，此突变体命名为F178Y。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4。本专利技术还提供了编码上述海藻糖合成酶或上述海藻糖合成酶突变体的基因。本专利技术还提供了携带上述基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒载体为pET-28a质粒、pET-22b质粒、pET-Duet质粒或pXMJ19质粒。本专利技术还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。本专利技术还提供了上述海藻糖合成酶的制备方法，所述方法为使用上述宿主细胞，先将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，然后将发酵液进行离心收集菌体，最后将菌体进行破碎获得海藻糖合成酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基可为LB培养基、TY培养基或TB培养基。本专利技术还提供了上述海藻糖合成酶突变体的制备方法，所述方法为使用上述宿主细胞，先将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，然后将发酵液进行离心收集菌体，最后将菌体进行破碎获得海藻糖合成酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基可为LB培养基、TY培养基或TB培养基。本专利技术还提供了一种生产海藻糖的方法，所述方法为使用上述海藻糖合成酶或上述海藻糖合成酶突变体或上述宿主细胞，将上述海藻糖合成酶或上述海藻糖合成酶突变体或上述宿主细胞添加入含有麦芽糖的反应体系中进行反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为使用上述宿主细胞，将上述宿主细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上划线后于37℃培养10～12h，得到活化后的宿主细胞单菌落；将得到的宿主细胞单菌落接入LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养10h，得到一级种子液；将得到的一级种子液以1％～2％的接种量转接到LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养至OD600为1.0～1.5，得到二级种子液；将得到的二级种子液转接入TY培养基中，于37℃、200rpm～400rpm的条件下培养至菌体浓度OD600达到18～20，得到培养液；在得到的培养液中添加0.2mmol/L的IPTG，于28℃、转速600rpm下继续培养12～14h，得到发酵液；将得到的发酵液在6000r/min的条件下离心20min，去除上清，收集菌体；将得到的菌体用pH7.0的缓冲液洗涤2～3次后用上述缓冲液配制的100～800g/L麦芽糖反应液进行悬浮，于35℃、200rpm的条件下进行全细胞转化反应24h，得到海藻糖。本专利技术还提供了一种可用于生产海藻糖的制剂，所述制剂的成分包含上述海藻糖合成酶或上述海藻糖合成酶突变体或上述宿主细胞。[有益效果](1)本专利技术海藻糖合成酶的酶活较高，将携带本专利技术海藻糖合成酶的大肠杆菌诱导培养12h，即可使粗酶液中海藻糖合成酶的比酶活高达35.2U/mg；将携带本专利技术海藻糖合成酶的谷氨酸棒杆菌诱导培养12h，即可使粗酶液中海藻糖合成酶的比酶活高达33.5U/mg；(2)本专利技术海藻糖合成酶的最适反应温度为35℃，适应温度较高，因此，在工业生产中具有生产成本低以及对生产条件要求低的优势；(3)本专利技术海藻糖合成酶突变体的比酶活与海藻糖转化率均较野生型海藻糖合成酶有了较为明显的提高，其中，海藻糖合成酶突变体K246A的比酶活较野生型酶提高了1.43倍，海藻糖转化率较野生型酶提高了约15％；海藻糖合成酶突变体A165T的比酶活较野生型酶提高了1.39倍，海藻糖转化率较野生型酶提高了约10％；海藻糖合成酶突变体F178Y的比酶活较野生型酶提高了1.18倍，海藻糖转化率较野生型酶提高了约5％；(4)将携带本专利技术海藻糖合成酶突变体的重组大肠杆菌全细胞作为催化剂加入含有麦芽糖的反应体系中，可在24h内将反应体系中的浓度为800g/L的麦芽糖转化为浓度为560g/L的海藻糖。具体实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体与海藻糖合成酶相比，第165位丙氨酸突变为了苏氨酸；编码所述海藻糖合成酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体与海藻糖合成酶相比，第165位丙氨酸突变为了苏氨酸；编码所述海藻糖合成酶的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.如权利要求1所述的一种海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQIDNo.3。


3.编码权利要求1或2所述海藻糖合成酶突变体的基因。


4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。


5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET-28a质粒、pET-22b质粒、pET-Duet质粒或pXMJ19质粒。


6.携带权利要求3所述基因或权利要求4或5所述重组质粒的宿主细胞。


7.如权利要求6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，吴傲，张显，徐美娟，杨套伟，邵明龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32