一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明专利技术提供了3个染料木素糖基化效率高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体L174P、L174Y和L174D，相比于野生型环糊精葡萄糖基转移酶，它们利用麦芽糊精为糖基供体生产糖基化染料木素时，长链糖基化染料木素合成产量分别提高了0.7、1.2和1.8倍，更利于糖基化染料木素的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法
本专利技术涉及一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。
技术介绍
染料木素(又名金雀异黄素、染料木黄酮等)被认为是一种活性功能最高的大豆异黄酮类物质。在豆科植物中，染料木素经常以其葡萄糖苷衍生物即染料木苷(又名4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷)的形式存在。染料木素在人体及动物细胞中具有广泛的药理学功效。主要表现为：1)具有化学防癌(乳腺癌和前列腺癌等)作用。染料木素具有类雌性激素及抗激素作用，可以抑制肿瘤细胞合成过程中相关酶的活性，在肿瘤细胞形成过程中抑制肿瘤血管增生，延缓或阻止肿瘤变成癌细胞。2)可以预防心血管疾病。染料木素会激发低密度的脂蛋白受体产生正向调节作用，同时可以促进胆固醇的清除，抑制血小板的凝集，对于动脉粥样硬化等疾病具有预防和治疗作用。3)可以预防绝经后疾病。染料木素是典型的植物雌激素，所具有的雌激素活性能够缓解妇女更年期综合症及预防绝经后疾病。4)抗骨质疏松作用。染料木素的雌激素活性能够激活雌激素受体，提高成骨细胞活性；另外还可以增加骨密度，抑制骨量丢失，对骨质疏松具有较好的改善作用。然而，染料木素具有很强疏水性，几乎不溶于水，在一般的有机溶媒中溶解度较差，而易溶于二甲基亚砜等有机溶剂。由于染料木素在水溶液中的溶解度极低，不仅限制了其作为食品添加剂、化妆品以及其他水溶性产品的应用，而且也大大降低了其作为口服药物及静脉注射药剂的药用效果，限制了其医药行业中的应用。因此，如何提高染料木素在水溶液中的溶解度，成为目前国内外关注的焦点。其中研究较多的是染料木素的糖基化衍生物。据报道二葡萄糖基染料木素和三葡萄糖基染料木素在水中的溶解度分别是染料木素的3700倍和44000倍。并且产物所连糖链越长，水溶性越好。糖基化染料木素相比与染料木素具有如下优点：1)与染料木素具有相似的生理生化功能；2)在体内水解为可被人体吸收的葡萄糖与染料木素，安全性较高；3)与染料木素相比水溶性明显的改善，拓展了其的应用范围。因此，长链糖基化染料木素衍生物具有更加广泛的应用前景。环糊精葡萄糖基转移酶(EC2.4.1.19)是目前常见的催化糖基化反应的酶。但是，由于环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)合成长链糖基染料木素效率较低，因此，急需找到提高环糊精葡萄糖基转移酶对长链糖基化染料木素合成效率的方法以推动与染料木素糖基衍生物相关行业的快速发展。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种染料木素糖基化效率高的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase,EC2.4.1.19)。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体与氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶(GenBankJX412224)相比，第174位亮氨酸进行了突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillusmacerans)。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体与氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶相比，第174位亮氨酸突变为了脯氨酸、酪氨酸或天冬氨酸。本专利技术还提供了编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。本专利技术还提供了含有上述基因的重组质粒。本专利技术还提供了含有上述重组质粒的基因工程菌。本专利技术还提供了一种构建上述基因工程菌方法，所述方法为将编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因连接到质粒，得到重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌，得到基因工程菌。本专利技术还提供了一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，所述方法为以上述基因工程菌为生产菌株，将上述基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；从发酵液中分离得到环糊精葡萄糖基转移酶。本专利技术还提供了上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在染料木素的糖基化方面的应用。本专利技术还提供了上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在食品、化工或纺织领域的应用。[有益效果]本专利技术提供了3个染料木素糖基化效率高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体L174P、L174Y和L174D，相比于野生型环糊精葡萄糖基转移酶，它们利用麦芽糊精为糖基供体生产糖基化染料木素时，长链糖基化染料木素合成产量分别提高了0.7、1.2和1.8倍，更利于糖基化染料木素的工业化生产。附图说明图1：野生型环糊精葡萄糖基转移酶和不同环糊精葡萄糖基转移酶突变体利用麦芽糊精为糖基供体生产不同糖基化染料木素的相对产量。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109以及大肠杆菌E.coliBL21(DE3)购自北纳生物，pET-20b(+)质粒购自Novagen公司(上述菌株大肠杆菌E.coliBL21(DE3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。下述实施例中涉及的培养基如下：LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl10.0g·L-1、氨苄青霉素100μg·L-1。LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl10.0g·L-1、琼脂粉15g·L-1、氨苄青霉素100μg·L-1。实施例1：染料木素糖基化效率高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体L174P、L174Y或L174D环糊精葡萄糖基转移酶突变体L174P、L174Y或L174D与氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶(GenBankJX412224)相比，第174位亮氨酸分别突变为了脯氨酸、酪氨酸或天冬氨酸。突变可通过化学全合成或PCR的方式完成。实施例2：染料木素糖基化效率高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体L174P、L174Y或L174D的制备方法化学合成编码氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因(基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)；将获得的基因与pET-20b(+)质粒经双酶切(NcoI和XhoI)后进行连接，转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的重组质粒pET20b-CGT；将测序正确的重组质粒pET20b-CG转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，获得重组大肠杆菌pET20b-CGT/E.coliBL21。利用全质粒PCR技术，以获得的重组质粒pET20b-CGT为模板进行定点突变；PCR产物经经DpnI处理后转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，于37℃培养8h，在LB固体培养基上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶相比，第174位亮氨酸进行了突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体与氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶相比，第174位亮氨酸进行了突变。


2.如权利要求1所述的一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillusmacerans)。


3.如权利要求1所述的一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体与氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶相比，第174位亮氨酸突变为了脯氨酸、酪氨酸或天冬氨酸。


4.编码权利要求1-3任一所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。


5.含有权利要求4所述基因的重组质粒。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩瑞枝，倪晔，柴宝成，姚栋，董晋军，许国超，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32