一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体S90G制造技术

本发明专利技术公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体S90G，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术通过对环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到了环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力更高的突变体。突变体S90G的摇瓶发酵酶歧化活力分别为野生酶的1.21倍。本发明专利技术对环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义，并提高了该酶的在食品、医药、化工行业中的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体S90G
本专利技术涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体S90G，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
环糊精葡萄糖基转移酶(CyclodextrinGlycosyltransferase，简称CGTase，EC2.4.1.19)是α-淀粉酶家族(GH13)中的主要成员。它作为一种多功能酶，可催化四种不同的反应，包括三种转糖基(transfructosylation，又称转糖苷)反应-歧化反应、环化反应和偶合反应以及一种水解反应。其中，歧化反应占据主导地位，该反应是将直链低聚糖被切断的部分转移到另一受体上，是一种分子外转糖基反应；环化反应作为一种分子内转糖基反应，这是CGTase的特征反应，其原理是将直链麦芽低聚糖上非还原端的O4或C4上的糖苷转移到同一直链还原端的C1或O1上。环化反应的逆反应就是偶合反应，它可以打开环糊精的环，将糖苷转移到直链麦芽低聚物上。CGTase同时具备催化环化反应和耦合反应的活性，是导致其在催化淀粉发生反应的过程中，随着时间延长，产物逐渐由α-环糊精向β-环糊精转变的原因。CGTase催化淀粉发生水解反应时，是将直链淀粉分子切断以后，将断开的两端分子都转移到水分子上，完成水解反应；CGTase催化水解反应的活性较弱。CGTase的应用比较广泛，最常见的就是通过环化反应把淀粉转化为环糊精。根据生成的环糊精种类的不同，可以把CGTase分为α-CGTase、β-CGTase、γ-CGTase，此外，还有报道显示CGTase能催化淀粉生产8个葡萄糖单元以上的环糊精。通过歧化和耦合反应，CGTase可以将转化淀粉或环糊精生成的单糖或低聚糖作为供体提供给各种受体分子，以改善其特性。例如，通过CGTase的歧化和偶合反应将小分子糖转移到蔗糖或果糖上而生产抗龋齿功能偶合糖；对甜菊苷、芸香苷、鼠李糖等物质进行糖基化修饰，显著改善其性能，使之可更加广泛地应用于食品、医药、化工等领域。Bacilluscirculans251来源的CGTase是一种典型的β-CGTase，其优秀的转糖基性能可被应用多个领域。但是，该CGTase歧化活力(约40U/mL)较其他来源的CGTase低，提高该酶歧化活力势在必行。
技术实现思路
专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的一个或多个氨基酸位点进行突变；这些位点包括：第6位的缬氨酸(Val)、90位的丝氨酸(Ser)、168位的苏氨酸(Thr)、171位的苏氨酸(Thr)、383位的苏氨酸(Thr)、608位的甘氨酸(Gly)。所述突变体催化歧化反应的活力有所提高。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于环状芽孢杆菌(B.circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。编码所述来源于环状芽孢杆菌(B.circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第6位的缬氨酸(V)突变为天冬氨酸，命名为V6D。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第90位的丝氨酸(T)突变为甘氨酸，命名为S90G。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第168位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸，命名为T168A。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第171位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸，命名为T171A。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第383位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸，命名为T383A。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第608位的甘氨酸(G)突变为丙氨酸，命名为G608A。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第228位的第6位的缬氨酸(V)突变为天冬氨酸，同时将第90位的丝氨酸(T)突变为甘氨酸，第168位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸，第171位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸，第383位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸，第608位的甘氨酸(G)突变为丙氨酸，命名为V6D/S90G/T168A/T171A/T383A/G608A。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体的制备方法，包括如下步骤：(1)在Bacilluscirculans251来源的环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化环糊精葡萄糖基转移酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌和真菌细胞，其也为本专利技术的保护范围。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。本专利技术的有益效果：本专利技术得到了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，突变体V6D、S90G、T168A、T171A、T383A、G608A和V6D/S90G/T168A/T171A/T383A/G608A的摇瓶发酵酶歧化活力分别为野生酶的1.89倍、1.21倍、1.21倍、1.22倍、1.32倍、2.03倍、3.16倍。本专利技术对环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义，并提高了该酶的在食品、医药、化工行业中的应用潜力。具体实施方式本专利技术的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下述实施例中涉及的培养基和检测方法如下：LB培养基(g·L-1)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。TB培养基(g·L-1)：胰蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O16.43，甘氨酸7.5。环糊精葡萄糖基转移酶催化歧化反应的活力的测定方法：以50mmol/LpH5.5的磷酸盐缓冲液为溶剂，分别配置12mM的EPS(4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷)和20mM麦芽糖溶液，各取300μL的12mMEPS和20mM麦芽糖溶液置于50℃水浴锅中预热，加入100μL稀释后的酶液，精确反应10min后，立刻煮沸10min终止反应，加入30μL稀释后的粗酶液，精确反应75min，于沸水中煮沸10min，冷却，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第90位的丝氨酸突变为甘氨酸，命名为S90G。/n

【技术特征摘要】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第90位的丝氨酸突变为甘氨酸，命名为S90G。


2.表达权利要求1所述突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心上清即为环糊精葡萄糖基转移酶突变体的粗酶液。...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，杜立，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32