一种(R)-ω-转氨酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种(R)‑ω‑转氨酶突变体及其应用，该突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸、第79位精氨酸、第51位的谷氨酰胺、第149位的缬氨酸、第235位亮氨酸和第216位甘氨酸，经多点突变得到。本发明专利技术通过基因挖掘技术筛选新型的(R)‑ω‑TA酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，获得了高酶活、高底物耐受性和高立体选择性的(R)‑ω‑TA突变体催化剂，该突变体能够生物催化前体酮类似物1‑(3‑氧吡咯烷‑1‑基)‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1,3‑丁二酮合成西他列汀中间体(R)‑1‑[3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酰基]吡咯‑3‑酮，且转化率较高，最高可达到95.4％，对于突破西他列汀生物催化制备技术具有里程碑意义。

【技术实现步骤摘要】
一种(R)-ω-转氨酶突变体及其应用
本专利技术涉及生物化工
，尤其涉及一种(R)-ω-转氨酶突变体及其应用，尤其是(R)-ω-转氨酶突变体在制备西他列汀中间体(R)-1-[3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酰基]吡咯-3-酮中的应用。
技术介绍
西他列汀，英文名称sitagliptin，全称(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，是由Merck和Codexis公司研制和开发的一种二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制药，可通过保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平，是一种有巨大潜力Ⅱ型糖尿病的治疗药物。制备西他列汀主要是不对称合成法，通常使用转氨酶为生物催化剂进行生物转化。转氨酶(transaminase，简称TA，EC2.6.1.X)是辅酶型PLP(5’-磷酸吡哆醛)依赖型酶。在反应过程中PLP与5’-磷酸吡哆胺(PMP)会相互进行转换，同时催化氨基从合适的供体到羰基受体的可逆转移。TA可以被分为α-TA和ω-TA。其中，ω-TA可以催化任何结构的酮和胺，具有更高的应用价值。催化制备西他列汀的酶属于(R)-ω-TA。Codexis公司以Arthrobactersp.来源的(R)-ω-TA117为研究对象，首先利用定点饱和突变对底物结合区域大口袋进行改造，获得突变体对1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-1,3-丁二酮(简称：截短前体酮)展现了催化活性。然后对该突变体进行11轮分子改造，最终获得了催化1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮(简称：前体酮底物)的高产突变体，催化活性较野生菌酶活提高了28000倍。(SavileCK,JaneyJM,MundorffEC,etal.BiocatalyticAsymmetricSynthesisofChiralAminesfromKetonesAppliedtoSitagliptinManufacture[J].Science，2010，329(5989):305-309.)。另外，还有其他以(R)-ω-TA不对称合成作为主要反应步骤合成sitagliptin的工艺路线。中国专利CN108586346A以1-(哌嗪-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮为底物，经如下工艺催化，如转氨酶胺化(如式I所示)、水解、氨基保护、缩合、脱保护等步骤获得西他列汀。转氨酶催化的底物浓度仅367mM，转化率为99.9％，底物浓度较低，不利于工业化大规模应用。在目前不对称合成西他列汀技术被Merck和Codexis公司垄断的情况下，应用(R)-ω-TA制备西他列汀其他技术工艺路线的底物浓度仍不具备竞争优势。在西他列汀转化工艺酶源单一、技术被垄断的背景下，亟需开发具有高活性、高立体选择性、高底物耐受的新型(R)-ω-TA突变体，突破现有的西他列汀生物催化制备技术壁垒，对于实现sitagliptin新制备技术的自主化、国产化具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种(R)-ω-转氨酶突变体及其应用，尤其涉及(R)-ω-转氨酶突变体在生物催化前体酮类似物1-(3-氧吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-1-[3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酰基]吡咯-3-酮中的应用，该(R)-ω-转氨酶突变体不仅具有较高的酶活，而且能够高效催化前体酮类似物制备西他列汀中间体(R)-1-[3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酰基]吡咯-3-酮，转化率最高可达95.4％。具体技术方案如下：一种(R)-ω-转氨酶突变体，该突变体为下列之一：(1)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为苏氨酸、组氨酸或丝氨酸；(2)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或甘氨酸；(3)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为赖氨酸或谷氨酸；(4)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为谷氨酸，第216位甘氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；(5)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为谷氨酸，第216位甘氨酸突变为丙氨酸。本专利技术通过野生型ω-转氨酶的筛选，得到立体选择性高的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的野生型AtTA酶，再利用多位点的定点突变，获得了具有较高酶活的(R)-ω-转氨酶突变体，能够生物催化前体酮类似物1-(3-氧吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-1-[3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酰基]吡咯-3-酮，且该中间体可以进一步通过常规化学法对西他列汀中间体(R)-1-[3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酰基]吡咯-3-酮进行水解、氨基保护、缩合和脱保护的后步骤，获得西他列汀。作为优选，所述(R)-ω-转氨酶突变体(核苷酸序列如SEQIDNO.3所示)，由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸(密码子为CTG)突变为甲硫氨酸(密码子为ATG)，第79位精氨酸(密码子为CGC)突变为丙氨酸(密码子为GCA)，第51位的谷氨酰胺(密码子为CAA)突变为丝氨酸(密码子为TCC)，第149位的缬氨酸(密码子为GTG)突变为天冬氨酸(密码子为GAC)，第235位亮氨酸(密码子为CTG)突变为谷氨酸(密码子为GAA)，第216位甘氨酸(密码子为GGC)突变为丙氨酸(密码子为GCT)。本专利技术提供了一种所述(R)-ω-转氨酶突变体的编码基因。本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。本专利技术还提供了所述(R)-ω-转氨酶突变体在生物催化前体酮类似物1-(3-氧吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-1-[3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酰基]吡咯-3-酮中的应用。本专利技术还提供了所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种(R)-ω-转氨酶突变体，其特征在于，该突变体为下列之一：/n(1)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为苏氨酸、组氨酸或丝氨酸；/n(2)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或甘氨酸；/n(3)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为赖氨酸或谷氨酸；/n(4)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为谷氨酸，第216位甘氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；/n(5)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为谷氨酸，第216位甘氨酸突变为丙氨酸。/n...

【技术特征摘要】
1.一种(R)-ω-转氨酶突变体，其特征在于，该突变体为下列之一：
(1)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为苏氨酸、组氨酸或丝氨酸；
(2)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或甘氨酸；
(3)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为赖氨酸或谷氨酸；
(4)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为谷氨酸，第216位甘氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；
(5)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为谷氨酸，第216位甘氨酸突变为丙氨酸。


2.如权利要求1所述的(R)-ω-转氨酶突变体，其特征在于，由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，第79位精氨酸突变为丙氨酸，第51位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第149位的缬氨酸突变为天冬氨酸，第235位亮氨酸突变为谷氨酸，第216位甘氨酸突变为丙氨酸。


3.一种如权利要求1所述(R)-ω...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，贾东旭，彭晨，李军良，程峰，张晓健，郑裕国，何人宝，金逸中，林娇华，
申请(专利权)人：浙江工业大学，浙江永太科技股份有限公司，浙江永太药业有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33