一种新型重组(R)-ω-转氨酶及其突变体和应用制造技术

技术编号:24882282 阅读:12 留言:0更新日期:2020-07-14 18:08
本发明专利技术公开了一种新型重组(R)‑ω‑转氨酶及其突变体和应用,该新型重组(R)‑ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第72位和第248位经单点或二点突变得到。本发明专利技术先通过基因重组技术获得高酶活的新型重组(R)‑ω‑转氨酶,再进一步通过定点突变获得新型重组(R)‑ω‑转氨酶突变体,该突变体不仅具有高酶活(1245.2U/g)、高立体选择特性(e.e.值99.9%),而且能够高效催化前体酮类似物制备西他列汀中间体,转化率最高可达97.4%。

【技术实现步骤摘要】
一种新型重组(R)-ω-转氨酶及其突变体和应用
本专利技术涉及生物化学
,尤其涉及一种新型重组(R)-ω-转氨酶及其突变体和应用。
技术介绍
西他列汀,英文名称sitagliptin,全称(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮,是由Merck和Codexis公司研制和开发的一种二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制药,可通过保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平,是一种有巨大潜力Ⅱ型糖尿病的治疗药物。制备sitagliptin主要是不对称合成法,通常使用转氨酶为生物催化剂进行生物转化。转氨酶(transaminase,简称TA,EC2.6.1.X)是辅酶型5’-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型酶。在反应过程中PLP与5’-磷酸吡哆胺(PMP)会相互进行转换,同时催化氨基从合适的供体到羰基受体的可逆转移。TA可以被分为α-TA和ω-TA。其中,ω-TA可以催化任何结构的酮和胺,具有更高的应用价值。催化制备sitagliptin的酶属于(R)-ω-TA。Codexis公司以Arthrobactersp.来源的(R)-ω-ATA-117为研究对象,首先利用定点饱和突变对底物结合区域大口袋进行改造,获得突变体对1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-1,3-丁二酮(简称:截短前体酮)展现了催化活性。然后对该突变体进行11轮分子改造,最终获得了催化1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮(简称:前体酮底物)的高产突变体,催化活性较野生菌酶活提高了28000倍。(SavileCK,JaneyJM,MundorffEC,etal.BiocatalyticAsymmetricSynthesisofChiralAminesfromKetonesAppliedtoSitagliptinManufacture[J].Science,2010,329(5989):305-309.)。DNA重组技术是将不同的遗传物质在体外进行剪切、拼接和组合,使遗传物质重新组合,然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内,进行无性繁殖,并使所需的基因在细胞内表达,产生人类所需的产物或是新生物的类型。利用分子生物学技术,可建立高效的新型转氨酶基因工程菌株,实现高活性、高稳定性、并且能满足工业化生产的转氨酶菌株。通过使用该方法能改进传统定点突变技术的不确定性,迅速获得高产工业菌株。重组DNA技术已经在细胞分化、生长发育、肿瘤发生等基础研究和工农业生产、医药保健等实际应用两方面取得了重要的突破。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新型重组(R)-ω-转氨酶、新型重组(R)-ω-转氨酶突变体及其应用,尤其涉及生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用,该新型重组(R)-ω-转氨酶和新型重组(R)-ω-转氨酶突变体不仅具有较高的酶活,而且能够高效催化前体酮类似物制备西他列汀中间体,尤其是新型重组(R)-ω-转氨酶突变体的转化率最高可达97.4%。具体技术方案如下:本专利技术提供了新型重组(R)-ω-转氨酶,该新型重组(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了编码该新型重组(R)-ω-转氨酶的核苷酸序列,具体如SEQIDNO.2所示。该新型重组(R)-ω-转氨酶是AtTA6的C端区域B1与CeTA5的N端区域A2重组获得。本专利技术还提供了新型重组(R)-ω-转氨酶突变体,该突变体为下列之一:(1)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第72位的天冬氨酸突变为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸或甘氨酸;(2)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第72位的天冬氨酸突变为甘氨酸,且第248位丙氨酸突变为赖氨酸、苏氨酸、丝氨酸、组氨酸或酪氨酸;(3)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第72位的天冬氨酸突变为甘氨酸,且第248位丙氨酸突变为丝氨酸。本专利技术在获得新型重组(R)-ω-转氨酶的基础上进行的单点和二点突变,获得了以上具有较高酶活的新型重组(R)-ω-转氨酶突变体,这些突变体能够高效催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。作为优选,该新型重组(R)-ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示,核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种所述的新型重组(R)-ω-转氨酶或所述的新型重组(R)-ω-转氨酶突变体的编码基因。本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。本专利技术还提供了所述新型重组(R)-ω-转氨酶或所述新型重组(R)-ω-转氨酶突变体在生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。本专利技术还提供了所述基因工程菌在生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。本专利技术还提供了一种催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的方法,包括:以前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮为底物,所述的新型重组(R)-ω-转氨酶、所述的新型重组(R)-ω-转氨酶突变体或所述的基因工程菌为生物催化剂,异丙胺为氨基供体,磷酸吡哆醛为辅酶,在缓冲溶液中进行生物催化合成反应,得到西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。进一步地,所述生物催化合成反应为35~50℃;所述缓冲溶液为三乙醇胺-HCl缓冲液,pH为8~9;所述底物的浓度为800~1200mM。其中,对于本专利技术提供的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的新型重组(R)-ω-转氨酶突变体而言,生物催化合成反应的温度在50℃时效果最佳,且当底物浓度为1000mM时,转化率最高,达到97.4%。与现有技术相比,本专利技术具有以下有益效果:本专利技术先通过基因重组技术获得高酶活的新型重组(R)-ω-转氨酶,再进一步通过定点突变获得新型重组(R)-ω-转氨酶突变本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.新型重组(R)-ω-转氨酶,其特征在于,该新型重组(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.新型重组(R)-ω-转氨酶,其特征在于,该新型重组(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.新型重组(R)-ω-转氨酶突变体,其特征在于,该突变体为下列之一:
(1)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第72位的天冬氨酸突变为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸或甘氨酸;
(2)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第72位的天冬氨酸突变为甘氨酸,且第248位丙氨酸突变为赖氨酸、苏氨酸、丝氨酸、组氨酸或酪氨酸;
(3)由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第72位的天冬氨酸突变为甘氨酸,且第248位丙氨酸突变为丝氨酸。


3.如权利要求2所述的新型重组(R)-ω-转氨酶突变体,其特征在于,该突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示,核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.一种如权利要求1所述的新型重组(R)-ω-转氨酶或如权利要求2所述的新型重组(R)-ω-转氨酶突变体的编码基因。


5.一种包含权利要求4所述编码基因的重组载体。


6.一种包含权利要求4所述编码基因的基因工程菌。


7.如权利要求1所述新型重组(R)-ω-转氨酶或权利要求2所述的新型重组(R)-ω-转氨酶突变体在生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,...

【专利技术属性】
技术研发人员:柳志强贾东旭彭晨李军良程峰张晓健郑裕国何人宝金逸中林娇华
申请(专利权)人:浙江工业大学浙江永太科技股份有限公司浙江永太药业有限公司
类型:发明
国别省市:浙江;33

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