9°N DNA聚合酶突变体制造技术

本发明专利技术提出了一种分离的蛋白质，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相比，具有选自下列至少之一位点的突变：第349位、第384位、第389位、第496位、第589位、第674位、第676位、第680位和第709位。本发明专利技术的9°N DNA聚合酶突变体相较于野生型具有较高的聚合活性，在测序过程中，酶反应的速度较快，缩短了测序反应时间，整体提升了酶催化效率。

9 \u00b0 n DNA polymerase mutant

【技术实现步骤摘要】
9°NDNA聚合酶突变体
本专利技术涉及生物领域。具体地，本专利技术涉及9°NDNA聚合酶突变体。更具体地，本专利技术涉及分离的蛋白质、分离的核酸、构建体、重组细胞、重组微生物、试剂盒及其在DNA复制中的用途以及获得分离的蛋白质的方法。
技术介绍
9°NDNA聚合酶属于B-familyDNA聚合酶，能够快速准确的复制DNA，是一种耐热的DNA聚合酶，应用范围广泛，其中最重要的一个应用就是应用于基因组测序中，例如：SBS测序。SBS测序方法中使用在3’糖羟基具有修饰的核苷酸，从而阻断其它核苷酸的加入。使用带有3’阻断基团的核苷酸允许以受控方式将核苷酸掺入多核苷酸链中。在加入每个核苷酸后，3’阻断基团的存在阻止其它核苷酸加入所述链中。在去除阻断基团后，恢复天然游离的3’羟基基团用于加入下一个核苷酸。然而，目前的9°NDNA聚合酶仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提出了一种9°NDNA聚合酶突变体，其具有较高的聚合活性，而且在测序过程中，酶反应的速度较快，缩短了测序反应时间，整体提升了酶催化效率。需要说明明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前SBS测序存在很多技术问题，如：测序的读长较短，反应的速率较慢等。因此，专利技术人尝试对9°NDNA聚合酶进行研究。通过去除野生型9°NDNA聚合酶的3’-5’外切酶活性，对该聚合酶的DNA结合区域、dNTP催化位点、蛋白其他结构域的计算机模拟和预测，筛选出一定量的优化突变位点，再对突变后的9°NDNA聚合酶进行实验筛选，得到一批可用的突变位点信息。9°NDNA聚合酶突变体相较于野生型具有较高的聚合活性，而且在测序过程中，酶反应的速度较快，缩短了测序反应时间，整体提升了酶催化效率。为此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种分离的蛋白质。根据本专利技术的实施例，与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列相比，所述分离的蛋白质具有选自下列至少之一位点的突变：第349位、第384位、第389位、第496位、第589位、第674位、第676位、第680位和第709位。专利技术人发现，使野生型9°NDNA聚合酶的上述位点发生突变，可以提高9°NDNA聚合酶的聚合活性，在测序过程中，酶反应的速度较快，缩短了测序反应时间，整体提升了酶催化效率。根据本专利技术的实施例，上述分离的蛋白质还可以具有下列附加技术特征：根据本专利技术的实施例，所述突变为氨基酸置换。根据本专利技术的实施例，与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列相比，所述分离的蛋白质具有选自下列至少之一的突变：p.T349F/I、p.Y384F/W、p.V389I/M、p.Y496I/L、p.V589H/Q、p.K674L/C、p.T676K/Y、p.V680M/E和p.R709S/H。根据本专利技术的实施例，所述分离的蛋白质具有选自下列之一的突变：(1)p.T676K和p.V680M；或者(2)p.T676K、p.V589H和p.V680M；或者(3)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.Y384F和p.R709S；或者(4)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.Y384F、p.R709S和p.V389I；或者(5)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.Y384F、p.Y496I和p.V389I；或者(6)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.Y384F和p.Y496I；或者(7)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.K674L、p.Y384F和p.V389I；或者(8)p.T676K、p.V589H、p.K674L、p.Y496I和p.Y384F。根据本专利技术的实施例，所述SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端进一步连接有4～8个组氨酸和/或SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种分离的核酸分子。根据本专利技术的实施例，所述分离的核酸分子编码前面所述的分离的蛋白质。根据本专利技术实施例的分离的核酸分子编码的9°NDNA聚合酶具有较高的聚合活性，在测序过程中，酶反应的速度较快，缩短了测序反应时间，整体提升了酶催化效率。根据本专利技术的实施例，与SEQIDNO：3所示的核苷酸序列相比，具有选自下列至少之一位点的突变：c.1045A>T、c.1046C>T、c.1151A>T、c.1151A>G、c.1152T>G、c.1165G>A、c.1167T>C、c.1167T>G、c.1486T>A、c.1486T>C、c.1487A>T、c.1488C>G、c.1765G>C、c.1766T>A、c.1767T>G、c.2020A>C、c.2020A>T、c.2021A>T、c.2021A>G、c.2022A>C、c.2026A>T、c.2027C>A、c.2028C>A、c.2028C>T、c.2038G>A、c.2039T>A、c.2040T>G、c.2040T>A、c.2125C>A、c.2126G>A、c.2127T>C。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种构建体。根据本专利技术的实施例，所述构建体含有前面所述分离的核酸分子。根据本专利技术实施例的构建体表达的9°NDNA聚合酶具有较高的聚合活性，在测序过程中，酶反应的速度较快，缩短了测序反应时间，整体提升了酶催化效率。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种重组细胞或者重组微生物。根据本专利技术的实施例，所述重组细胞或者重组微生物含有前面所述分离的核酸分子。由此，根据本专利技术实施例的重组细胞或者重组微生物表达的9°NDNA聚合酶具有较高的聚合活性，在测序过程中，酶反应的速度较快，缩短了测序反应时间，整体提升了酶催化效率。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种获得前面所述分离的蛋白质的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：在适于所述分离的蛋白质表达的条件下，培养前面所述的重组细胞或者重组微生物，以便获得所述分离的蛋白质。由此，以便获得具有高聚合活性的9°NDNA聚合酶，在测序过程中，酶反应的速度较快，缩短了测序反应时间，整体提升了酶催化效率。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒含有前面所述分离的蛋白质或者前面所述分离的核酸分子或者前面所述构建体或者前面所述重组细胞或者重组微生物。由此，利用根据本专利技术实施例的试剂盒能够使得在测序过程中酶反应的反应速度加快，缩短了测序反应时间，整体提升了酶催化效率。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了前面所述分离的蛋白质或者前面所述分离的核酸分子或者前面所述构建体或者前面所述重组细胞或者重组微生物或者前面所述的试剂盒在DNA复制中的用途。由此，DNA复制效率较高，在测序过程中，可以缩短了测序反应时间，提高测序效率。本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的蛋白质，其特征在于，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相比，具有选自下列至少之一位点的突变：/n第349位、第384位、第389位、第496位、第589位、第674位、第676位、第680位和第709位。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的蛋白质，其特征在于，与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列相比，具有选自下列至少之一位点的突变：
第349位、第384位、第389位、第496位、第589位、第674位、第676位、第680位和第709位。


2.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，其特征在于，所述突变为氨基酸置换。


3.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，其特征在于，与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列相比，所述分离的蛋白质具有选自下列至少之一的突变：
p.T349F/I、p.Y384F/W、p.V389I/M、p.Y496I/L、p.V589H/Q、p.K674L/C、p.T676K/Y、p.V680M/E和p.R709S/H；
任选地，与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列相比，所述分离的蛋白质具有选自下列之一的突变：
(1)p.T676K和p.V680M；或者
(2)p.T676K、p.V589H和p.V680M；或者
(3)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.Y384F和p.R709S；或者
(4)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.Y384F、p.R709S和p.V389I；或者
(5)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.Y384F、p.Y496I和p.V389I；或者
(6)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.Y384F和p.Y496I；或者
(7)p.T676K、p.V589H、p.V680M、p.K674L、p.Y384F和p.V389I；或者
(8)p.T676K、p.V589H、p.K674L、p.Y496I和p.Y384F。


4.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，其特征在于，所述SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端进一步连接有4～8个组氨酸和/或SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。


5.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟莉莉，郑越，王林，董宇亮，章文蔚，徐崇钧，刘芬，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44