一种葡萄糖氧化酶突变体及其在工业化生产中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖氧化酶突变体及其在工业化生产中的应用。本发明专利技术的葡萄糖氧化酶突变体，与野生型葡萄糖氧化酶相比，其热稳定性有了显著的提升，特别适合应用于工业化生产中，例如，应用于食品、化工、医药、农业和饲料领域中。

A glucose oxidase mutant and its application in industrial production

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖氧化酶突变体及其在工业化生产中的应用
本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其在工业化生产中的应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase,GOD,E.C1.1.3.4)是一种需氧脱氢酶，该酶分子为二聚体，含有两个亚基，分子量约160kDa，每个亚基结合一个FAD分子。它能利用分子氧作为电子受体，专一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD广泛分布于动植物和微生物体内，从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富，细菌GOD产酶量少。微生物发酵法是生产GOD的主要来源。目前市场上大部分商业产品都是由毕赤酵母和丝状真菌，如黑曲霉，米曲霉等发酵生产。葡萄糖氧化酶由于具有催化专一性和高效性的优点，在食品、化工、医药、农业、饲料等领域有比较广泛的应用，近年来倍受关注，市场需求量也越来越大。由于葡萄糖氧化酶的除氧和抗氧化作用，使其在食品、医药、饲料等方面应用非常广泛。在食品工业中，葡萄糖氧化酶作为一种食品保鲜剂，在防止啤酒老化、保持产品原有风味、延长保质期方面有显著效果，还可作为面粉改良剂和面包品质改良剂提高食品质量。在医药领域中普遍采用葡萄糖氧化酶电极法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。作为一种新型的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶能够改善动物肠道环境，提高饲料利用率，促进动物生长。随着葡萄糖氧化酶越来越多的被应用于各个领域，工业上尤其是饲料工业对其现有性能有了越来越高的要求，如在常温下较长时间保持酶活力不下降，对热和极端pH条件具有耐受性，对消化酶具有耐受性。其中酶的热稳定性对于葡萄糖氧化酶的应用非常关键，在酶的制备过程中和极端反应条件下(高温)，耐热性强的酶有着比较大的优势。因此，提高葡萄糖氧化酶热稳定性对葡萄糖氧化酶的广泛推广和应用具有重要的现实意义
技术实现思路
本专利技术提供葡萄糖氧化酶突变体，与野生型葡萄糖氧化酶相比，其热稳定性有了显著的提升，有利于该酶在工业化生产中应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供一种葡萄糖氧化酶突变体，所述葡萄糖氧化酶突变体在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第19、25、67、92、96、121、141、142、278、305、362、449、453、477、506、521、526、528、536、560或572位氨基酸发生了取代。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述取代为T19Y、A25V、A67Y、A92Q、S96F、S121A、L141K、Q142K、N278Y、M305P、S362F、A449M、Q453N、S477Y、Y506W、C521A、K526R、M528L、A536L、V560L或S572A。在本专利技术的另一些实施方案中，所述的葡萄糖氧化酶突变体在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第25、67、92、96、121、141、142、449、453、477、506、521、526、528、536、560或572位氨基酸发生了取代。在本专利技术的另一些具体实施方案中，所述取代为A25V、A67Y、A92Q、S96F、S121A、L141K、Q142K、A449M、Q453N、S477Y、Y506W、C521A、K526R、M528L、A536L、V560L或S572A。在本专利技术的又一些实施方案中，所述的葡萄糖氧化酶突变体在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第67、92、96、121、142、453、477、506、528、560或572位氨基酸发生了取代。在本专利技术的又一些具体实施方案中，所述取代为A67Y、A92Q、S96F、S121A、Q142K、Q453N、S477Y、Y506W、M528L、V560L或S572A。在本专利技术的一些优选实施方案中，所述的葡萄糖氧化酶突变体在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第96、121、506、560或572位氨基酸发生了取代。在本专利技术的一些优选具体实施方案中，所述取代为S96F、S121A、Y506W、V560L或S572。在本专利技术的一些更优选实施方案中，所述的葡萄糖氧化酶突变体在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第96位或第572位氨基酸发生了取代。在本专利技术的一些更优选具体实施方案中，所述取代为S96F或S572A。在本专利技术的一些特别优选实施方案中，所述的葡萄糖氧化酶突变体，在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第96位氨基酸发生了取代。在本专利技术的一些特别优选具体实施方案中，所述取代为S96F。在本专利技术的一些特别优选实施方案中，所述的葡萄糖氧化酶突变体，在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第572位氨基酸发生了取代。在本专利技术的一些特别优选具体实施方案中，所述取代为S572A。本专利技术中A，R，C，Q，N，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V分别是丙氨酸Ala，精氨酸Arg，半胱氨酸Cys，谷氨酰胺Gln，天冬酰胺Asn，亮氨酸Leu，赖氨酸Lys，甲硫氨酸Met，苯丙氨酸Phe，脯氨酸Pro，丝氨酸Ser，苏氨酸Thr，色氨酸Trp，酪氨酸Tyr，缬氨酸Val的缩写。术语“取代”指所在位置的氨基酸被替换成另一个氨基酸，例如，572位的氨基酸发生“取代”，表示为S572A。本专利技术还提供编码所述葡萄糖氧化酶突变体的多核苷酸。本专利技术还提供了一种重组表达载体，其包含上述编码所述葡萄糖氧化酶突变体的多核苷酸。本专利技术还提供了一种宿主细胞，其包含上述重组表达载体。在本专利技术的一些实施方案中，上述所述的宿主细胞是真菌细胞，优选酵母细胞或丝状真菌细胞，更优选毕赤酵母细胞或黑曲霉细胞。本专利技术再一方面提供所述葡萄糖氧化酶突变体在食品、化工、医药、农业或饲料领域中的应用。本专利技术的葡萄糖氧化酶突变体，与野生型葡萄糖氧化酶相比，其热稳定性有了显著的提升，具体的，在70℃条件下处理3min后，与野生型葡萄糖氧化酶相比，优选的葡萄糖氧化酶突变体的酶活提高了30％以上，更优选的葡萄糖氧化酶突变体的酶活提高了40％以上，特别优选的葡萄糖氧化酶突变体酶活提高了50％以上，尤其优选的葡萄糖氧化酶突变体酶活提高了80％以上，特别适合应用于工业化生产中，例如，应用于食品、化工、医药、农业和饲料领域中。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本专利技术，而非对本专利技术范围的限制。实施例1：葡萄糖氧化酶单点耐热突变体库的构建来源于黑曲霉(Aspergillusniger)的葡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，在对应于SEQ ID NO:1的位置，与SEQ IDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第25、67、92、96、121、141、142、449、453、477、506、521、526、528、536、560或572位氨基酸发生了取代。/n

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第25、67、92、96、121、141、142、449、453、477、506、521、526、528、536、560或572位氨基酸发生了取代。


2.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述取代为A25V、A67Y、A92Q、S96F、S121A、L141K、Q142K、A449M、Q453N、S477Y、Y506W、C521A、K526R、M528L、A536L、V560L或S572A。


3.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第67、92、96、121、142、453、477、506、528、560或572位氨基酸中发生了取代。


4.根据权利要求3所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述取代为A67Y、A92Q、S96F、S121A、Q142K、Q453N、S477Y、Y506W、M528L、V560L或S572A。


5.根据权利要求3所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，在对应于SEQIDNO:1的位置，与SEQIDNO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶相比，第96、121、506、560或572位氨基酸发生了取代。


6.根据权利要求5所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述取代为S96F、S121A、Y506W、V560L或S572A。


7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑斐，严婷，朱继东，徐红，孙艳，
申请(专利权)人：南京百斯杰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32