一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用，所提供的重组杆状病毒，其中包含有编码新城疫病毒HN、F蛋白的核苷酸片段；所述的HN和F蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8。本发明专利技术所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备新城疫病毒的病毒样颗粒；本发明专利技术所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗。本发明专利技术通过对新城疫病毒HN、F蛋白的cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的cDNA序列。再对HN和F蛋白进行优化改造后，利用昆虫细胞‑杆状病毒表达系统制备病毒样颗粒，病毒蛋白产量显著高于SPF胚培养的病毒，生产成本明显降低。

A recombinant baculovirus and its application in preparation of Newcastle disease virus like particles

【技术实现步骤摘要】
一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用
本专利技术属于基因工程疫苗
，具体涉及一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用。
技术介绍
新城疫(Newcastledisease,ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevlrus,NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病。自1926年首发于印度尼西亚和英国新城以来，在近90多年的历史中，新城疫在全世界曾发生过多次大流行。新城疫给我国的养禽业带来了巨大的经济损失，严重威胁我国养禽业的发展，故新城疫的防治十分重要。新城疫病毒属于副粘病毒科，副粘病毒属，核酸为单链RNA。由螺旋形对称盘绕的核衣壳和囊膜组成。囊膜表面有放射状排列的纤突，含有刺激宿主产生血凝抑制和病毒中和抗体的抗原成分；其中F蛋白、HN糖蛋白是新城疫病毒的主要宿主免疫保护性抗原。目前，F蛋白、HN糖蛋白已成为研制新城疫病毒亚单位疫苗、重组活载体疫苗、DNA疫苗及新城疫病毒载体疫苗的热点，并且已在多种系统中得到表达。杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)。AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Andersonetal.,1995；Wangetal.,2001；Ribeiroetal.,2001)。在我国主要以疫苗接种来防控该病的蔓延，传统疫苗使用完整的病原体作为制苗用抗原，存在一定的安全风险。且全病毒的使用会对病毒造成选择压力，加速病毒的变异。与传统疫苗相比，将NDV基因组中一个或多个保护性抗原在原核或真核细胞中表达从而制备成亚单位疫苗更具有安全性能高、稳定性好、易于批量生产及生产成本低等优点。
技术实现思路
本专利技术提供一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用，使用重组杆状病毒制备的病毒样颗粒可用来制备疫苗，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种重组杆状病毒，其中包含有编码新城疫病毒HN、F蛋白的核苷酸片段；所述的HN和F蛋白，其氨基酸序列分别为SEQIDNO:6；SEQIDNO:8；所述的核苷酸片段，其一种具体序列为SEQIDNO:5；SEQIDNO:7；本专利技术所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备新城疫病毒的病毒样颗粒；本专利技术再一个方面提供一种新城疫病毒的病毒样颗粒，是使用上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9；本专利技术所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗；本专利技术还提供一种新城疫病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本专利技术制备的病毒样颗粒。本专利技术通过对新城疫病毒HN、F蛋白的cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的cDNA序列。再对HN和F蛋白进行优化改造后，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备病毒样颗粒(VLPS)，病毒蛋白产量显著高于SPF胚培养的病毒，生产成本明显降低。具体实施方式本专利技术构建的用于表达抗原蛋白的重组杆状病毒，在昆虫细胞中能成功地表达出可溶性的HN、F蛋白，两个蛋白在体内自动组装成病毒样颗粒(VLPS)。VLP在空间构象上更类似与天然病毒，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，且由于VLP不含有病毒核酸，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高，可以减少新城疫全病毒疫苗免疫对病毒变异带来的压力，减少病毒的变异。因此，利用基因工程手段研制NDV-HN-F疫苗是NDV新型疫苗研究的热点和方向。利用本专利技术的可以生产出NDV-HN-F(VLP)亚单位疫苗，具有商业使用价值。下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1、新城疫病毒HN蛋白、F蛋白2018年申请人从山东某养鸡场的鸡群中分离出一株新城疫病毒。将病料按1:5(w/v)比例加入到含双抗的生理盐水中，研磨制成悬液，1000r/min离心5分钟，取上清尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，36℃～37℃孵化3～4日，每日照胚2次，取24小时后死亡的鸡胚，置2～8℃冷却8～16小时，收获鸡胚液，进行HA及HI试验。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明分离的毒株是新城疫病毒，无细菌、支原体及外源病毒污染；纯化后的病毒株命名为YBF1907。对筛选鉴定的YBF1907株的HN、F基因进行了序列分析，其中HN基因全长1716bp(核苷酸序列为SEQIDNO:1)，编码572个氨基酸(氨基酸序列为SEQIDNO:2)；F基因全长1662bp(氨基酸序列为SEQIDNO:3)，编码554个氨基酸(氨基酸序列为SEQIDNO:4)。将其与GenBank中收录的HN、F基因序列进行遗传进化树及核苷酸序列同源性分析，发现YBF1907株HN氨基酸与GenBank中同源性最近的AGL09067.1相比，第46位(Y变K)、第111位(S变R)、第142位(V变S)、第182位(T变P)、第310位(G变F)、第328位(T变S)、第443位(M变T)、第563位(V变G)发生了变异，同源性为98.6％；F氨基酸与GenBank中同源性最近的QCX35354.1相比，第22位(T变P)、第80位(P变V)、第150位(S变T)、第151位(I变S)、168位(V变G)、190位(F变T)、519位(L变G)、520位(A变V)，同源性约98.3％。抗原蛋白分析结果表明筛选病毒的HN、F蛋白与已报道的新城疫病毒的HN、F基因存在着氨基酸差异，这将导致目前的疫苗无法预防新流行毒株，研究新流行毒株的亚单位疫苗迫在眉睫。实施例2：表达HN和F基因的重组杆状病毒的构建1、HN和F基因的剪切、优化将HN基因的N端结构域前的45个氨基酸的跨膜区剪切掉；将N端加上起始密码子ATG；同时根据昆虫细胞的偏爱性对密码子进行优化，其优化后的核苷酸序列为SEQIDNO:5，氨基酸序列为SEQIDNO:6。将F基因N端前142氨基酸剪切掉，加上起始密码子ATG；C端的53个氨基酸剪切的跨膜区剪掉，同时进行密码子的优化，其优化后的核苷酸序列为SEQIDNO:7，氨基酸序列为SEQIDNO:8。进行剪切、优化的序列以及未经剪切优化的序列均由上海生物工程有限公司进行合成，并连入克隆载体。2、HN阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述的重组杆状病毒中包含有编码新城疫病毒HN、F蛋白的核苷酸片段；所述的HN和F蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述的重组杆状病毒中包含有编码新城疫病毒HN、F蛋白的核苷酸片段；所述的HN和F蛋白，其氨基酸序列分别为SEQIDNO:6；SEQIDNO:8。


2.如权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述的核苷酸片段，其序列为SEQIDNO:5、SEQIDNO:7。


3.权利要求1或2所述的重组杆状病毒在昆虫细胞中制备新城疫病毒的病毒样颗粒的应用。


4.一种新城疫病毒的病...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟伟，李金积，王宗升，陈俭梅，向银辉，刘大卫，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37