一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法技术

本发明专利技术属于微生物基因工程领域，公开了一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法。本发明专利技术提供的螺旋霉素产生菌的菌株中的Lrp基因失活(Δlrp‑SP)，菌株的保藏号为CGMCC No.16056；本发明专利技术提供的可利霉素产生菌的菌株中的Lrp基因失活(Δlrp‑BT)，菌株的保藏号为CGMCC No.16055。本发明专利技术通过使Lrp基因失活，提高了螺旋霉素和可利霉素的产量，尤其是可利霉素的主组分4”‑异戊酰螺旋霉素Ⅲ的产量和比例明显提高。

The invention relates to a spiramycin producing strain, a clindamycin producing strain, a construction method, an application and a method for increasing the product yield

【技术实现步骤摘要】
一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法
本专利技术属于微生物基因工程领域，涉及一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法，具体涉及调控基因的运作与提高抗生素产量及有效组分的方法及其应用。
技术介绍
可利霉素曾用名生技霉素、必特螺旋霉素，是利用合成生物学技术，将碳霉素产生菌(Streptomycesthermotolerans)中4”-异戊酰基转移酶基因(ist)在螺旋霉素产生菌(StreptomycesspiramyceticusF21)中进行克隆表达，获得的基因工程菌(StreptomycesspiramyceticusWSJ-1)的发酵产物[专利号：ZL971044406、ZL021487715]。可利霉素为多组分抗生素，以4”-异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ为主组分，其中Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ组分以3位OR基团，依次为丙酰基、乙酰基、羟基而命名。可利霉素结构式如下：可利霉素结构式异戊酰螺旋霉素Ⅲ：R＝COCH2CH3R′＝COCH2CH(CH3)2异戊酰螺旋霉素Ⅱ：R＝COCH3R′＝COCH2CH(CH3)2异戊酰螺旋霉素Ⅰ：R＝HR′＝COCH2CH(CH3)2可利霉素作为一类新药已近入新药审批阶段，其质量标准中规定Ⅲ组分应不低于30％。链霉菌中存在一系列调控基因，激活或抑制其转录可以提高其次级代谢产物的生物合成，从而提高其产量(BekkerVetal.Bioengineered.2014,5(5):293-299)。亮氨酸反应蛋白(Leucine-responsiveregulatoryprotein,Lrp)是一类调控转录因子，通过与调控基因启动子序列的结合，激活或抑制调控基因的转录活性，调控诸多微生物的生理代谢(PeetersEetal.Archaea.2010,ArticleID750457；UnoarumhiYetalBMCEvolBiol.201616(1):111)，如支链氨基酸的代谢、鞭毛的合成、毒力因子的抑制、多胺内稳态和甲醇的同化等过程(HaneySAetal.JBacteriol.1992,174(1):108-115；BraatenBAetal.ProcNatlAcadSciUSA.1992,89(10):4250-4；BaekCHetalJBacteriol.2009,191(4):1278-92；IshiiYetal.JBiosciBioeng.2018,125(1):67-75；GonzalezJEetal.MetabEng.201845:67-74)。然而Lrp基因在抗生素生物合成中的功能和作用至今研究报道较少，只有Liu等(LiuJ.atal.ApplMicrobiolBiotechnol.2017,101(14):5773-5783)在天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor中发现Lrp蛋白家族Lrp/AsnC调节因子SCO3361，其编码基因的缺少导致放线紫红素产量的明显降低，同时，在固体培养基气生菌丝和孢子的形成受到抑制，认为它是一个多效性调节因子，调控次级代谢及形态的发育(LiuJatal.MetabEng.2017,39:29-37)；他们同时在红霉素产生菌Saccharopolysporaerythraea发现一个SACE_Lrp基因，其缺失可以提高红霉素的发酵产量(LiuJetal.MetabEng.2017,39:29-37)。改造lrp基因提高抗生素组分产量和比例的研究至今未见报道。有鉴于此特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法。本专利技术通过使Lrp基因失活，提高了螺旋霉素的产量，其衍生物可利霉素的主组分-4”-异戊酰螺旋霉素Ⅲ的产量和比例也大大提高。为解决上述技术问题，本专利技术采用技术方案的基本构思是：本实验室在螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus1941，通过生物信息学分析发现一个orf_5591-lrp基因，其与S.flavidovirens的Lrp/AsnC家族转录调控因子的同源性分别为93％/34％。通过分析S.spiramyceticus中的正调控基因orf42(srm40同源基因)和orf23(srm22同源基因)启动子区和S.thermotolerans中的正调控基因acyB2与ist基因间序列，发现均含有Lrp的特征结合序列YAGHAWATTWTDCTR(H＝非G，W＝A或T，D＝非C)，本专利技术目的在于通过对lrp基因的改造提高螺旋霉素及其衍生物可利霉素的主组分-4”-异戊酰螺旋霉素Ⅲ的产量和比例。本专利技术的第一目的是提供一种螺旋霉素产生菌，菌株中的Lrp基因失活，所述菌株的保藏号为CGMCCNo.16056。本专利技术的第二目的是提供一种可利霉素产生菌，菌株中的Lrp基因失活，所述菌株的保藏号为CGMCCNo.16055。进一步的方案，上述的螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌中，所述的Lrp基因的核苷酸序列如Seq.1所示；优选的，Lrp蛋白的氨基酸序列如Seq.2所示。本专利技术的第三目的是提供一种螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌的构建方法，包括：(1)构建用于将Lrp基因失活的重组载体，导入到螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌中；(2)筛选获得Lrp基因失活的重组菌。进一步的方案，以螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌基因组为模板，以完全或部分敲除Lrp基因为原则，在适合位点设计引物，PCR扩增左右臂基因片段，克隆至敲除载体，构建重组载体，导入螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌中，通过抗性和传代筛选获得Lrp基因失活的重组菌。本专利技术的第四目的是提供一种螺旋霉素产生菌在提高螺旋霉素产量中的应用，螺旋霉素产生菌中的Lrp基因失活。本专利技术的第五目的是提供一种可利霉素产生菌在提高可利霉素Ⅲ组分产量中的应用，可利霉素产生菌中的Lrp基因失活。本专利技术的第六目的是提供一种提高螺旋霉素和/或可利霉素Ⅲ组分产量的方法，包括：(1)改造螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌的染色体上的Lrp基因，使Lrp基因失活；(2)用步骤(1)中改造后的螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌进行发酵生产。优选的方案，螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌中Lrp基因失活后，通过提高与螺旋霉素相关生物合成途径相关基因、丙氨酸生物合成途径相关基因和酰基辅酶A代谢途径相关基因的表达来提高螺旋霉素和/或可利霉素Ⅲ组分产量。进一步的方案，改造后的螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌经过种子培养、发酵培养后，提取发酵液，获得的发酵产物经HPLC检测分析。进一步的方案，上述的Lrp基因失活包括插入、突变、部分敲除，或者全部敲除。采用上述技术方案后，本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：本专利技术改造螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌的染色体上的Lrp基因，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种螺旋霉素产生菌，其特征在于，菌株中的Lrp基因失活，所述菌株的保藏号为CGMCC No.16056。/n

【技术特征摘要】
1.一种螺旋霉素产生菌，其特征在于，菌株中的Lrp基因失活，所述菌株的保藏号为CGMCCNo.16056。


2.一种可利霉素产生菌，其特征在于，菌株中的Lrp基因失活，所述菌株的保藏号为CGMCCNo.16055。


3.根据权利要求1所述的螺旋霉素产生菌，或者权利要求2所述的可利霉素产生菌，其特征在于，所述的Lrp蛋白的氨基酸序列如Seq.2所示；
优选的，Lrp基因的核苷酸序列如Seq.1所示。


4.一种螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌的构建方法，其特征在于，包括：
(1)构建用于将Lrp基因失活的重组载体，导入到螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌中；
(2)筛选获得Lrp基因失活的重组菌。


5.根据权利要求4中所述的构建方法，其特征在于，以螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌基因组为模板，以完全或部分敲除Lrp基因为原则，在适合位点设计引物，PCR扩增左右臂基因片段，克隆至敲除载体，构建重组载体，导入螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌中，通过抗性和传代筛选获得Lrp基因失活的重组菌。


6.一种螺旋霉素产生菌在提高螺旋霉素产量中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赫卫清，赵小峰，姜勋雷，姜勋东，
申请(专利权)人：沈阳福洋医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21