滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法技术

本发明专利技术涉及一种滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法，属于育种领域。本发明专利技术的技术方案是材料种植与常规方法相同，将待鉴定材料播种及移栽种植；移栽１５－４０天取叶片，提取水稻总ＤＮＡ；测定样品ＤＮＡ浓度并将ＤＮＡ定量稀释为２５ｎｇ／ｕｌ；然后用位于水稻第１０染色体的且与滇型恢复基因紧密连锁的微卫星标记ＯＳＲ３３、ＲＭ２２８作引物，进行ＰＣＲ反应；聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染法检测ＰＣＲ产物及电泳结果；再鉴定待测材料有无恢复基因，能否作滇型杂交稻的恢复系。本发明专利技术可快速、有效筛选滇型杂交稻的恢复系。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法，属于农业生物
，更具体地说属于育种领域。
技术介绍
水稻是我国重要的粮食作物之一，上世纪70年代杂交水稻的育成为我国粮食生产、解决温饱问题做出了巨大的贡献。1998年的统计表明，我国杂交水稻种植面积约占水稻面积的50％以上，累计增产粮食3500亿千克。滇型杂交粳稻自1973年滇型杂交粳稻实现三系配套以来，迄今已育成十种不同细胞质类型的滇型不育系，并组配成功一序列优良的粳型杂交组合，为粮食生产作出了贡献。尽管如此，滇型杂交稻的应用一直无大的突破，其主要原因是滇型不育系没有现成的品系可作恢复系，恢复基因只存在于籼稻中，不存在于粳稻品种中，而且不是所有的籼稻都具有恢复基因。此外，选育滇型恢复系时，没有形态特征可用于鉴别恢复系。所以，选育优良的恢复系一直是滇型杂交稻育种中的重点和难点。目前，选育滇型恢复系必须通过籼粳交，从籼稻中引入恢复基因，然后再经过后代测恢。这一方法需经历两个生长季节，需要人工测交及田间鉴定程序，必须具有田间测恢所需的不育系，而且结果的准确性常受环境条件的影响。目前，还没有一种技术较完善、有效的滇型杂交稻恢复系选择鉴定的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有滇型恢复系选育方法的不足，提供一种快速、高效、准确的鉴定滇型恢复系的方法。本专利技术的技术方案是保持目前粳稻恢复系选育的田间栽培方式，种植材料之间的株距、行距和密度、田间的栽培管理、种子的繁殖方法均与常规方法相同，其步骤是将待鉴定材料播种及移栽种植；移栽15-40天取叶片，提取水稻总DNA；测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul；然后用位于水稻第10染色体的且与滇型恢复基因紧密连锁的微卫星标记OSR33、RM228作引物，进行PCR反应；聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染法检测PCR产物及电泳结果；用微卫星标记OSR33、RM228作引物时，含恢复基因，可作恢复系材料的PCR产物的分子量分别是320bp，250bp；不能作滇型杂交稻恢复系的材料，其PCR产物的分子量为330bp、270bp，由此鉴定待测材料有无恢复基因，能否作滇型杂交稻的恢复系。用微卫星标记OSR33或RM228作引物，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下反应液组成ddH2O6-10ul、10×buffer 2ul、MgCl2(25mM)2ul，dNTP(2.5umol/L)2ul、引物(2umol/L)各2ul，模板DNA 1-3ul、Taq酶0.5-1.5U，总体积18-25ul扩增程序93-95℃4min；93-95℃1min、50-60℃1min、68-75℃1min，35个循环；72℃4min本专利技术的有益效果是由于利用了分子遗传学及分子生物学技术，结合我们对滇型恢复基因精确标记及分子定位的结果，从稻种资源及籼粳交后代中早期筛选鉴定恢复系，减少育种的盲目性，提高育种效率，为组配强优势组合、解决杂交粳稻面临的问题提供了有力的工具。具体表现为1、用OSR33、RM228鉴别恢复系准确性高，其中OSR33鉴定选择恢复系的准确率为96％、RM228为92％，而且时间上只需一个生长季节，缩短了育种进程；2、选择不受季节及材料数量的限制，避免了人工测交及田间鉴定的繁琐程序，且不需田间测恢必需的不育系。附图说明图1是用微卫星标记OSR33作引物，经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测所得到的电泳图谱。图2是用微卫星标记RM228作引物，经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测所得到的电泳图谱。具体实施例具体实施方式为选择106份不能作滇型恢复系的材料、179份滇型恢复系材料，按常规方法的田间栽培管理模式种植(栽插规格为148.8cm×154cm，每行10苗，单本栽插)。待移栽15-40天后，取叶片提取DNA，测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul，然后PCR扩增，最后用银染法检测鉴定。实施例一移栽15天后取叶片提DNA，PCR反应液组成及扩增程序如下所述反应液组成ddH2O6ul、10×buffer2ul、MgCl2(25mM)2ul，dNTP(2.5umol/L)2ul、引物(2umol/L)各2ul，模板DNA 1ul、Taq酶0.5U，总体积17ul扩增程序93℃4min；93℃1min、50℃1min、68℃1min，35个循环；72℃4min试验结果见表1。表1黑染花粉率与群体标记基因型间的相关关系及分子鉴定准确率<tables id=table1 num=001><table width=786>OSR33RM228相关关系及T测验分子鉴定准确率相关关系及T测验分子鉴定准确率与黑染花粉率的相关系数(r)T值分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)与黑染花粉率的相关系数(r)T值分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)0.8613※※22.4195.3294.880.8102※※17.6191.4592.06</table></tables>T0.05值为1.96，T0.01值为2.63实施例二移栽30天后取叶片提DNA，PCR反应液组成及扩增程序如下所述反应液组成ddH2O 8ul、10×buffer 2ul、MgCl2(25mM)2ul，dNTP(2.5umol/L)2ul、引物(2umol/L)各2ul，模板DNA 2ul、Taq酶0.5U，总体积20ul扩增程序94℃4min；94℃1min、55℃1min、72℃1min，35个循环；72℃4min试验结果见表2。表2黑染花粉率与群体标记基因型间的相关关系及分子鉴定准确率<tables id=table2 num=002><table width=786>OSR33RM228相关关系及T测验分子鉴定准确率相关关系及T测验分子鉴定准确率与黑染花粉率的相关系数(r)T值分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)与黑染花粉率的相关系数(r)T值分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)0.8913※※24.4196.3296.180.8302※※19.7192.4592.36</table></tables>T0.05值为1.96，T0.01值为2.63实施例三移栽40天后取叶片提DNA，PCR反应液组成及扩增程序如下所述反应液组成ddH2O 12ul、10×buffer 2ul、MgCl2(25mM)2ul，dNTP(2.5umol/L)2ul、引物(2umol/L)各2ul，模板DNA 3ul、Taq酶1.5U，总体积25ul扩增程序95℃4min；95℃1min、60℃1min、75℃1min，35个循环；72℃4min试验结果见表3。表3黑染花粉率与群体标记基因型间的相关关系及分子鉴定准确率<tables id=table3 num=003><table width=786>OSR33RM228相关关系及T测验分子鉴定准确率相关关系及T测验分子鉴定准确率与黑染花粉率的相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法，保持目前粳稻恢复系选育的田间栽培方式，种植材料之间的株距、行距和密度、田间的栽培管理、种子的繁殖方法均与常规方法相同，其步骤是：　１）将待鉴定材料播种及移栽种植；２）移栽１５－４０天取 叶片，提取水稻总ＤＮＡ；３）测定样品ＤＮＡ浓度并将ＤＮＡ定量稀释为２５ｎｇ／ｕｌ；４）然后用位于水稻第１０染色体的且与滇型恢复基因紧密连锁的微卫星标记ＯＳＲ３３、ＲＭ２２８作引物，进行ＰＣＲ反应；５）聚丙烯酰胺凝胶电 泳；６）银染法检测ＰＣＲ产物及电泳结果；７）用微卫星标记ＯＳＲ３３、ＲＭ２２８作引物时，含恢复基因，可作恢复系材料的ＰＣＲ产物的分子量分别是３２０ｂｐ，２５０ｂｐ；不能作滇型杂交稻恢复系的材料，其ＰＣＲ产物的分子量为３３０ｂ ｐ、２７０ｂｐ，由此鉴定待测材料有无恢复基因，能否作滇型杂交稻的恢复系。

【技术特征摘要】
1一种滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法，保持目前粳稻恢复系选育的田间栽培方式，种植材料之间的株距、行距和密度、田间的栽培管理、种子的繁殖方法均与常规方法相同，其步骤是1)将待鉴定材料播种及移栽种植；2)移栽15-40天取叶片，提取水稻总DNA；3)测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul；4)然后用位于水稻第10染色体的且与滇型恢复基因紧密连锁的微卫星标记OSR33、RM228作引物，进行PCR反应；5)聚丙烯酰胺凝胶电泳；6)银染法检测PCR产物及电泳结果；7)用微卫星标记OSR33、RM228作引物时，含恢复基因，可作恢复系材料的PCR产物的分子量分别是320bp，250bp；不能作滇型杂交稻恢复系的材料，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭学林，谭亚玲，张忠林，赵银河，张雪梅，黄大军，金寿林，洪汝科，许红云，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]