棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法，具体提供了用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的CAPS标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和3所示。本发明专利技术采用CAPS标记对棉花细胞质雄性不育恢复系材料进行了分子水平的多态性检测，该方法鉴定速度快、准确率高、操作简单，非常适用于棉花细胞质雄性不育恢复系材料纯度的室内鉴定和新恢复系材料的分子标记辅助选育。

【技术实现步骤摘要】
棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法
本专利技术属于生物
，涉及鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的分子标记，扩增其的引物以及分子鉴定方法。
技术介绍
杂种优势的研究和利用在提高棉花产量、改进品质、提高抗性等方面已经发挥了显著效果。目前，杂交棉已经在我国长江流域等育苗移栽地区广泛栽种；在黄河流域棉区，甚至新疆等直播棉区也正在大力发展杂交棉。然而，人工去雄辅助授粉杂交制种法是杂交棉种子的主要生产方式（占90%以上）。随着国家城镇化发展的需求，棉花主产区及其周边地区的劳动力成本逐年提高，从而导致种子生产成本越来越高，许多从事杂交棉制种的相关种子企业难以为继，最终大大限制了杂交棉的进一步大规模推广利用。利用“三系法”制种已经在多种作物中得到成功应用和推广，与人工去雄辅助授粉方式相比，该方法具有程序简便，成本仅为人工去雄杂交的30-40%，适合大面积制种等独特优势。因而，三系杂交棉花的大面积推广，对于提高植棉效益，增加棉农收益，稳定杂交棉种植面积等都具有重要意义。虽然，三系杂交种（以哈克尼西棉细胞质雄性不育三系材料为主）的审定已经取得了一定进展，但是受制于具有强恢复力的优良恢复系亲本资源匮乏的限制，目前，仍然没有实现三系杂交棉的大面积推广。因此，在三系杂交棉选育过程中，具有强恢复力的优良恢复系选育和改良是育种工作者长期研究的重点和难点。采用常规育种技术可以实现恢复系改良的目的，但是利用该方法需要年限长，而且转育后每年都需要进行大量的田间测交和鉴定来确保恢复基因的存在，从而需要耗费大量的棉田、人力和财力。另一方面，三系杂交种制种过程中，恢复系的纯度至关重要，一旦混杂，将直接导致杂交种后代出现不育株的情况，严重影响棉花产量。常规育种过程中棉花细胞质雄性不育恢复系选育田间鉴定检测方法所需时间长、消耗大、准确性差，因此，迫切需要一种稳定可靠又快速的鉴定恢复系纯度和选育改良的方法。分子标记直接从DNA水平反映出核苷酸序列的差异，不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，具有遗传稳定等特点。目前，随着分子生物学的飞速发展，分子标记检测技术已经发展出几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有RFLP、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、CAPS、STS、AFLP和SNP等。酶切扩增多态性序列（CAPS,cleavedamplifiedpolymorphicsequence）标记技术是一种具有共显性、位点特异性、操作简单、成本低的简单、经济、可靠的技术。与SSR等需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和银染的分子标记技术相比，该技术仅需通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，因此已经在种质鉴定、辅助育种、基因鉴定和图谱构建等领域得到相当广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决常规育种过程中棉花细胞质雄性不育恢复系选育田间鉴定检测方法所需时间长、消耗大、准确性差等的问题，提供一种棉花细胞质雄性不育恢复系的快速分子鉴定方法，从而可以加快棉花恢复系选育和改良进程，同时保证恢复系种子纯度。为了实现上述的目的，本专利技术利用前期筛选到的与恢复基因紧密连锁的SSR标记【曹秀霞，哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因SSR标记定位及利用，中国农业科学院，作物遗传育种，2012，硕士论文】，结合雷蒙德氏棉（D基因组）测序的结果【WangK,WangZ,LiF,etal(2012)ThedraftgenomeofadiploidcottonGossypiumraimondii.NatureGenetics44(10):1098】，得到9个可能与恢复基因相关的PPR（pentatricopeptiderepeats）基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.4-12所示。进一步对这9个PPR基因在陆地棉恢复系、保持系和不育系中的测序发现，恢复系中存在一段特异的“TtAATTTCAcattaatta”片段（SEQIDNo.1，其中小写字母为恢复系特有插入碱基，斜体为恢复系中存在的SNP位点），这段序列的存在导致恢复系中缺失了限制性内切酶DraI的酶切位点。本专利技术提供了含有上述特异片段的分子标记。以此为基础，本专利技术设计了涵盖这一特异片段的一对CAPS标记引物对：正向引物5'-AAACAGCTATACCTCAAAGGCAA-3'（SEQIDNo.2）反向引物5'-TTTAGTTAAATTATCATTTTCGCCTA-3'（SEQIDNo.3）本专利技术提供了上述分子标记在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。本专利技术提供的用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的CAPS标记引物，其为核苷酸序列如SEQIDNO.2和3所示的引物。该引物在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用以及在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了一种棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法，包括以下步骤：（1）用SEQIDNO.2和3所示的引物扩增待测棉花样品的基因组DNA，回收扩增产物；（2）扩增产物经限制性内切酶酶切后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳条带出现184bp和124bp两个特异性条带，而没有出现317bp的扩增片段的待测样品为不含恢复基因位点的棉花材料；若电泳条带出现317bp的同时，还出现184bp和124bp两个特异性条带，则待测样品为恢复基因位点杂合的棉花材料；若电泳条带仅有317bp条带，没有出现184bp和124bp这两个特异性条带，则待测样品为恢复基因位点纯合的棉花材料。其中步骤（2）的内切酶为DraI。其中，酶切时间为30min。步骤（1）中，DNA样品1μl与19μlPCR反应液（10×PCRBuffer（含MgCL2）2.0μl，5mMdNTPs0.2μl，10mMCAPS引物对各1μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，ddH2O14.6μl）混合，进行PCR反应：94℃预变性3min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；4℃保存。步骤（2）中，吸取15μl扩增产物与5μl酶切反应液（10×Buffer2μl，15U/μlDraI1μl，ddH2O2μl）混合，37℃酶切30min。酶切产物10μl加样于2～3%的琼脂糖凝胶中，在1×TAE的电泳缓冲液中电泳检测。本专利技术的另一个目的在于提供用所述的标记或引物在鉴定棉花恢复系纯度和新恢复系选育中的应用。在本专利技术一个优选的实施方案中，用所述的CAPS标记引物扩增待测棉花样本的基因组DNA，经限制性内切酶DraI酶切后筛选出与恢复系具有相同带型的棉花样本。本专利技术采用CAPS标记对棉花细胞质雄性不育恢复系材料进行了分子水平的多态性检测，从本研究的结果中可以看出，该标记鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠，因此该方法非常适用于棉花细胞质雄性不育恢复系材料纯度的室内鉴定和新恢复系材料的分子标记辅助选育。本专利技术与现有技术相比，有益效果为：1）速度快：CAPS标记对棉花细胞质雄性不育恢复系材料选育和保证恢复系种子纯度具有重要作用。棉花三系杂交种制种过程中，如果发生恢复系混杂将在杂交后代中产生不育棉株，从而对棉花产量造成重大影响，并严重影响棉农受益。此外，常规育种程序恢复系的选育过程涉及大量的测交等试验，并且需要调查大量的外部性状，需要投入大量的时间、人力和本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的分子标记，其特征在于，其含有一段特异的片段，该特异片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的分子标记，其特征在于，所述分子标记由核苷酸序列如SEQIDNO.2和3所示的引物经PCR扩增棉花基因组DNA得到；且所述分子标记含有一段特异的片段，该特异片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的分子标记在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。3.权利要求1所述的分子标记在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。4.用于通过PCR扩增权利要求1所述分子标记，从而鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的CAPS标记引物，其特征在于，其为核苷酸序列如SEQIDNO.2和3所示的引物。5.权利要求4所述的引物在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。6.权利要求4所述的引物在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建勇，邢朝柱，郭立平，戚廷香，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41