绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体制造技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及绵羊Lrh‑1短发夹RNA及其干扰载体。本发明专利技术根据绵羊Lrh‑1基因的cDNA序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计有短发夹RNA结构的单链寡核苷酸，经变性退火为双链寡核苷酸插入融合有绿色荧光的pENTR/U6载体，构建pENTR/U6‑shRNA‑GFP干扰载体。通过转染到湖羊卵巢颗粒细胞中，利用实时荧光定量PCR方法在mRNA水平检测，证实Lrh‑1‑shRNA干扰载体可以有效抑制绵羊体细胞中Lrh‑1基因的表达。

LRH-1 short hairpin RNA of sheep and its interference vector

【技术实现步骤摘要】
绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体。
技术介绍
肝受体同系物-1(Liverreceptorhomolog-1,Lrh-1)是一种哺乳动物重要的核受体，属于核受体超家族中的NR5A亚家族的第2个成员，也称NR5A2，在动物的心、胃、肺、脑、胆囊、胰腺外分泌部、唾液腺、肠、卵巢、脂肪、膀胱、睾丸、肾上腺、胎盘等多种组织中均有表达。Lrh-1主要是以一种转录调控因子执行其功能，通过在不同时期的不同组织中调控多种蛋白的表达，从而影响这些组织的发育及生理生化功能，并在动物胚胎发育、分化、胆固醇代谢、胆汁酸的动态平衡、类固醇激素生成、乳腺癌的细胞转移和侵袭、组织炎症反应等过程中具有重要作用。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrandRNA，dsRNA)导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。RNA干扰技术的出现使得以特定的方式特异性沉默靶基因成为可能，并逐渐成为治疗疾病和基因功能研究的高效工具。目前，RNAi技术开辟了生命科学新的研究领域，成为21世纪国际生命科学的研究热点和前沿。为了反向深入研究绵羊细胞中Lrh-1基因功能，需要对Lrh-1基因进行干扰、沉默、敲减或敲除，但目前尚未见Lrh-1基因的敲除或敲减的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体，该短发夹RNA能够对目的基因Lrh-1产生良好的敲减作用。本专利技术提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其正义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列1、序列B；其中，序列A与序列B反向互补；所述序列A如SEQIDNO:1～3任一项所示。本专利技术提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其反义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列2、序列B；所述茎环序列2与茎环序列1反向互补。本专利技术提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA中，反义链和正义链中的序列A是一致的，序列B也是一致的。一些具体实施例中，所述序列A为GCACGGACTTACACCTATTGT(SEQIDNO:1)，序列B为ACAATAGGTGTAAGTCCGTGC(SEQIDNO:10)；一些具体实施例中，所述序列A为GGAATAAGTTCGGGCCCATGT(SEQIDNO:2)，序列B为ACATGGGCCCGAACTTATTCC(SEQIDNO:11)；一些具体实施例中，所述序列A为GCACAGGAATTGGTGGCAAAG(SEQIDNO:3)，序列B为CTTTGCCACCAATTCCTGTGC(SEQIDNO:12)；本专利技术提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA的正义链和反义链的5’端皆连接有接头，所述正义链的接头序列为CACC；所述反义链的接头序列为AAAA。本专利技术提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA中，所述茎环序列1的核酸序列为CGAA。茎环序列2的核酸序列为TTCG。一些实施例中，所述绵羊Lrh-1短发夹RNA正义链的核酸序列如SEQIDNO:4所示，反义链的核酸序列如SEQIDNO:5所示；或正义链的核酸序列如SEQIDNO:6所示，反义链的核酸序列如SEQIDNO:7所示；或正义链的核酸序列如SEQIDNO:8所示，反义链的核酸序列如SEQIDNO:9所示。本专利技术还提供了由本专利技术所述正义链和反义链退火合成的dsOligo。具体的，本专利技术提供了由SEQIDNO:4所示正义链和SEQIDNO:5所示反义链退火形成的dsOligo。或由SEQIDNO:6所示正义链和SEQIDNO:7所示反义链退火形成的dsOligo。或由SEQIDNO:8所示正义链和SEQIDNO:9所示反义链退火形成的dsOligo。本专利技术还提供了绵羊Lrh-1基因的干扰载体，其包括骨架载体和所述的dsOligo。在本专利技术实施例中，所述骨架载体为pENTR/U6-shRNA-GFP。一些具体实施例中，所述dsOligo插入骨架载体的位点为BamHI和EcoRI。本专利技术还提供了一种敲减绵羊Lrh-1基因的方法，其以本专利技术所述的干扰载体转染受体。所述转染采用脂质体转染法。所述受体为动物细胞或绵羊的卵巢颗粒细胞。具体为293T细胞或湖羊卵巢颗粒细胞。本专利技术还提供了一种Lrh-1基因被敲减的细胞系，其以本专利技术所述的干扰载体转染细胞构得。一种敲减绵羊Lrh-1基因的试剂盒，其包括所述的短发夹RNA、所述的dsOligo或所述的干扰载体。本专利技术所述的试剂盒中，还包括转染试剂。本专利技术构建了一种Lrh-1短发夹RNA，并构建了Lrh-1基因的干扰载体，具体而言，本专利技术根据绵羊Lrh-1基因的cDNA序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计有短发夹RNA结构的单链寡核苷酸，经变性退火为双链寡核苷酸插入融合有绿色荧光的pENTR/U6载体，构建pENTR/U6-shRNA-GFP干扰载体。通过转染到湖羊卵巢颗粒细胞中，利用实时荧光定量PCR方法在mRNA水平检测，证实Lrh-1-shRNA干扰载体可以有效抑制绵羊体细胞中Lrh-1基因的表达。这一干扰载体实现了对绵羊体细胞基因组的精确打靶，为深入研究绵羊体细胞中Lrh-1基因与其他基因功能间关系，提供了有效地实验研究技术依据。本专利技术具有以下优点及效果中至少一种：(1)RNA(Lrh-1-shRNA)短发夹干扰载体，可直接用于转染绵羊细胞，特异性抑制Lrh-1基因表达，进行RNAi实验。(2)RNA(Lrh-1-shRNA)干扰载体融合有GFP标签，可在荧光显微镜下直观监测转染效率。(3)RNA(Lrh-1-shRNA)干扰载体的构建为绵羊Lrh-1基因功能的深入研究提供了便利。附图说明图1示本专利技术设计的shRNA；图2示本专利技术的干扰载体图谱；图3示细胞转染图片；图4示GAPDH基因的扩增曲线(a)和溶解曲线(b)；图5示Lrh-1基因的扩增曲线(a)和溶解曲线(b)。具体实施方式本专利技术提供了绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1Lrh-1高表达载体构建1.材料：pMD18-Tvector、oli本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.绵羊Lrh-1短发夹RNA，其正义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列1、序列B；其中，序列A与序列B反向互补；所述序列A如SEQ ID NO:1～3任一项所示。/n

【技术特征摘要】
1.绵羊Lrh-1短发夹RNA，其正义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列1、序列B；其中，序列A与序列B反向互补；所述序列A如SEQIDNO:1～3任一项所示。


2.根据权利要求1所述的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其特征在于，其反义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列2、序列B；所述茎环序列2与茎环序列1反向互补。


3.根据权利要求1或2所述的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其特征在于，所述正义链和反义链的5’端皆连接有接头，所述正义链的接头序列为CACC；所述反义链的接头序列为AAAA。


4.根据权利要求1～3任一项所述的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其特征在于，所述茎环序列1的核酸序列为CGAA。


5.根据权利要求1～4任一项所述的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其特征在于，
正义链的核酸序列如SEQIDNO:4所示，反义链的核酸序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王利红，张伟，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32