稳定期特异性启动子及其应用制造技术

本发明专利技术提供30个稳定期特异性启动子(序列如SEQ ID NO:1‑30所示)及其应用。本发明专利技术提供的稳定期诱导的启动子主要集中在菌体生长稳定期启动重组表达，这对于发酵生产具有很重要的意义，特别是在发酵生产对宿主细胞有毒性的产品等。在发酵过程中，在稳定期时才会启动表达，避免了因宿主细胞受到毒害而导致减产。本发明专利技术为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供有力的技术支持。

Stable phase specific promoter and its application

【技术实现步骤摘要】
稳定期特异性启动子及其应用
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种稳定期特异性启动子序列及其应用。
技术介绍
赖氨酸脱羧酶(lysinedecarboxylase,简称LDC,分类号为EC4.1.1.18)广泛存在于微生物、动物和高等植物中，其可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO2。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。目前，微生物法戊二胺生产主要采用微生物发酵生产和微生物体外酶催化生产戊二胺。利用微生物发酵生产或微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺时，使用较多的是根据乳糖操纵子来构建赖氨酸脱羧酶基因表达盒，CN105441497A中通过构建结构为LacIq-IPTG/乳糖诱导型启动子(Ptac)-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的表达盒，使得赖氨酸脱羧酶基因分泌表达。而使用这种方法在大规模工业生产时需额外添加乳糖，增加了生产成本。研究人员发现原核生物体内自然存在着一些启动子是当菌体生长到稳定期后才会启动下游基因的表达的，称为稳定期诱导的启动子，或称稳定期特异性启动子，如csiE，bolA，osmY，katE等。除此之外，还需进一步开发在稳定期特异性诱导的且能够高水平驱动目的基因表达的新型启动子。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供稳定期特异性启动子及其应用。本专利技术的另一目的是提供一步法发酵生产1,5-戊二胺的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术人提供的稳定期诱导的启动子能够在稳定期利用微生物大量表达异源蛋白，为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供技术支持。进一步地，为了实现一步法发酵生产1,5-戊二胺，将编码赖氨酸脱羧酶的基因构建至具有生产L-赖氨酸能力的菌株中。考虑到若赖氨酸脱羧酶和赖氨酸同时表达，生成的具有毒性的1,5-戊二胺会影响细胞生长。于是采用稳定期启动子，以使菌株先发酵生产赖氨酸，进入稳定期后再发酵生产赖氨酸脱羧酶，减少产物1,5-戊二胺对菌体生长的不利影响。第一方面，本专利技术提供的稳定期特异性启动子，所述启动子的大小为37-45bp，至少包括-10区、RNA聚合酶бs特异性识别位点和-35区；其中，将所述启动子序列的3’末端碱基对应于下游基因转录起始位点的位置记为-1位，所述-10区位于-12～-7位，碱基组成为5’-TATACT-3’；所述启动子序列的-13位碱基为C；所述RNA聚合酶бs特异性识别位点位于-18～-14位，碱基组成为5’-TTGTT-3’；所述-35区的碱基组成为5’-TCCCGCC-3’或5’-TCCCGAC-3’，且所述-35区和-10区之间间隔的碱基数为15-20bp。进一步地，所述稳定期特异性启动子的序列为：i)SEQIDNO:1-30任一所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:1-30任一所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:1-30任一所示序列杂交且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列。第二方面，本专利技术提供含有所述稳定期启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。第三方面，本专利技术提供所述稳定期启动子的以下任一应用：1)作为原核生物的稳定期特异性启动子的应用；2)在构建重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌中的应用。所述原核生物为细菌，例如埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、哈夫尼菌属(Hafnia)中的细菌；优选地，所述细菌选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。进一步地，本专利技术提供所述稳定期启动子作为大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)在发酵生产赖氨酸脱羧酶中调控赖氨酸脱羧酶基因表达的稳定期特异性启动子的用途，或者作为大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)在发酵生产1,5-戊二胺中调控赖氨酸脱羧酶基因表达的稳定期特异性启动子的用途。第四方面，本专利技术提供一种重组DNA，由所述启动子与下游目的基因可操作连接而成。本专利技术中，所述目的基因选自编码蛋白质的核酸、编码核酶的核酸、编码反义RNA的核酸；优选地，所述蛋白质为酶、激素、抗体或生长因子；更优选地，所述酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。进一步地，所述裂合酶为脱羧酶；所述脱羧酶为氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。又进一步地，所述赖氨酸脱羧酶来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiellaoxytoca)。更进一步地，所述赖氨酸脱羧酶由cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段所编码。更进一步优选由cadA基因编码的赖氨酸脱羧酶。第五方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体包含所述的重组DNA。在一些实施例中，所述表达载体携带含有赖氨酸脱羧酶基因的表达盒，且所述表达盒由所述稳定期特异性启动子驱动赖氨酸脱羧酶基因的表达。第六方面，本专利技术提供一种转化体，所述转化体为携带所述表达载体的宿主菌。所述宿主菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、哈夫尼菌属(Hafnia)中的菌种；优选地，所述宿主菌选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.sub本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.稳定期特异性启动子，其特征在于，所述启动子的大小为37-45bp，至少包括-10区、RNA聚合酶б

【技术特征摘要】
1.稳定期特异性启动子，其特征在于，所述启动子的大小为37-45bp，至少包括-10区、RNA聚合酶бs特异性识别位点和-35区；
其中，将所述启动子序列的3’末端碱基对应于下游基因转录起始位点的位置记为-1位，所述-10区位于-12～-7位，碱基组成为5’-TATACT-3’；
所述启动子序列的-13位碱基为C；
所述RNA聚合酶бs特异性识别位点位于-18～-14位，碱基组成为5’-TTGTT-3’；
所述-35区的碱基组成为5’-TCCCGCC-3’或5’-TCCCGAC-3’，且所述-35区和-10区之间间隔的碱基数为15-20bp。


2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子为：
i)SEQIDNO:1-30任一所示的核苷酸序列；或
ii)SEQIDNO:1-30任一所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与SEQIDNO:1-30任一所示序列杂交且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列。


3.含有权利要求1或2所述启动子的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。


4.权利要求1或2所述启动子的以下任一应用：
1)作为原核生物的稳定期特异性启动子的应用；
2)在构建重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌中的应用。


5.一种重组DNA，其特征在于，由权利要求1或2所述启动子与下游目...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玲，周豪宏，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术股份有限公司，CIBT美国公司，
类型：发明
国别省市：上海;31