一种RPL6-shRNA及其在治疗结直肠癌中的应用制造技术

本发明专利技术提出了一种RPL6‑shRNA分子，为针对核糖体蛋白RPL6的核苷酸序列设计的shRNA分子，能够显著抑制结直肠癌细胞HCT116的生长。RPL6‑shRNA的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的优点是能显著降低HCT116肿瘤细胞内RPL6的表达水平，高效抑制体外培养的HCT116细胞增殖速率。因此，本发明专利技术设计的shRPL6分子具有治疗结直肠癌的潜能。

Rpl6 shRNA and its application in the treatment of colorectal cancer

【技术实现步骤摘要】
一种RPL6-shRNA及其在治疗结直肠癌中的应用
本专利技术涉及一种RPL6-shRNA及其在作为结直肠癌治疗靶点中的应用，分类号为C12N15/113，属于生物医药

技术介绍
结直肠癌是目前最常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命和健康，其发病率位居常见恶性肿瘤的前列，其病死率也居癌症死亡的前列。结直肠癌的发生发展是一个多步骤、多阶段以及多基因参与的过程，其中基因异常表达在结肠癌发生发展过程中又起着重要作用。因此，寻找出新的结直肠癌治疗靶点对疾病的治疗，降低直结肠癌死亡率具有重要的科学意义。肿瘤靶向治疗是针对肿瘤特异性表达的功能分子，设计开发靶向性的抑制剂，包括抗体、小分子、生物载体等。该类靶向性分子可以特异性抑制肿瘤细胞的生长、运动及化疗抵抗等功能，而对正常的组织细胞不具有破坏作用。因此，靶向治疗可以极大的延长患者的生存时间及生存质量。然而，现阶段可用的靶向治疗靶点有限，可用的靶向药匮乏，只有极少部分患者可以从靶向治疗中受益，因此提供一种新型的肿瘤治疗靶点是目前亟需解决的问题。核糖体蛋白（RibosomalProtein，RP）是参与构成核糖体的所有蛋白质的统称，是组成核糖体的主要成分，在细胞内蛋白质生物合成中发挥重要作用。研究发现，核糖体蛋白还具有参与DNA修复、调控发育和细胞分化等核糖体外功能，并且在胃癌、结直肠癌、食管癌和肝癌等恶性肿瘤组织中，一些核糖体蛋白编码基因高表达。核糖体蛋白L6（RibosomalProteinL6，RPL6），又称Taxreb107。该蛋白定位于核仁，但当其表达量过高时，在核基质内也能检测到其存在（王冀姝等.核糖体蛋白L6/Taxreb107的核定位信号的分析.生物化学与生物物理进展.2002;29(1):144-8）。早期研究发现，RPL6的过表达可以保护胃癌细胞免受药物诱导的细胞凋亡（GouY,etal.RibosomalproteinL6promotesgrowthandcellcycleprogressionthroughupregulatingcyclinEingastriccancercells.Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2010,393(4):788-93.）。RPL6与HDM2可相互作用，并且RPL6和HDM2形成了一个自动调节反馈回路（BaiD,etal.RegulationoftheHDM2-p53pathwaybyribosomalproteinL6inresponsetoribosomalstress.NucleicAcidsResearch,2014,42(3):1799-1811.）。因此，RPL6是一个潜在的肿瘤治疗靶点。近年来，RNA干扰技术经历着高速发展，也为癌症治疗带来了新的曙光和革命性的转变。RNA干扰技术作为一种新兴的癌症治疗方法，具有巨大的潜力和发展前景。短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）是一类人工合成的具有紧密的发夹转弯结构的RNA，它可以通过RNA干扰技术的原理沉默靶向基因的表达。因此，为了研究某个潜在治疗靶点在肿瘤治疗中的意义，可通过shRNA干扰技术进行验证。针对治疗靶点设计包含两段反向重复序列的短发夹RNA，并将其编码序列克隆至表达载体pLKO.1上，然后利用表达的shRNA分子干扰治疗靶点的表达，从而影响靶点的功能，以评价所述shRNA分子能否抑制肿瘤细胞的生长以及是否具有治疗恶性肿瘤的潜能。如何利用RNA干扰技术，研究出特异性针对恶性肿瘤细胞的shRNA，为结直肠癌等相关癌症的治疗提供一种有益的途径。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供一种RPL6-shRNA及其在治疗结直肠癌中的应用，RPL6-shRNA是以RPL6为靶标，设计出的特异性shRNA分子，能够达到抑制恶性肿瘤细胞生长的目的。本专利技术提供了一种RPL6-shRNA，所述RPL6-shRNA为针对核糖体蛋白RPL6的核苷酸序列设计的shRNA分子，能够显著抑制结直肠癌细胞HCT116的生长。RPL6-shRNA的序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。本专利技术根据核糖体蛋白RPL6的编码序列设计了一种针对RPL6的shRNA分子（即shRPL6）。将表达shRPL6的质粒包装慢病毒，感染人肿瘤细胞HCT116后，能显著降低胞内RPL6的mRNA和蛋白质水平，并能高效抑制体外培养的HCT116细胞增殖速率。优选地，所述RPL6-shRNA包含用于沉默人源RPL6基因的靶点序列。优选地，所述靶点序列为CAGAAAGCTGTGGACTCACAA，其对应编码区为748-768核苷酸位点。优选地，所述RPL6-shRNA包含正义链和反义链，所述正义链的寡核苷酸序列为：5’-CCGGCAGAAAGCTGTGGACTCACAACTCGAGTTGTGAGTCCACAGCTTTCTGTTTTTGGATCC-3’；所述反义链的寡核苷酸序列为：5’-AATTGGATCCAAAAACAGAAAGCTGTGGACTCACAACTCGAGTTGTGAGTCCACAGCTTTCTG-3’。优选地，所述靶点序列为GCCGCTAAATCCAAGGTTGAA，其对应编码区为223-243核苷酸位点。优选地，所述RPL6-shRNA包含正义链和反义链，所述正义链的寡核苷酸序列为：5’-CCGGGCCGCTAAATCCAAGGTTGAACTCGAGTTCAACCTTGGATTTAGCGGCTTTTTGGATCC-3’；所述反义链的寡核苷酸序列为：5’-AATTGGATCCAAAAAGCCGCTAAATCCAAGGTTGAACTCGAGTTCAACCTTGGATTTAGCGGC-3’。本专利技术还提供了RPL6-shRNA在治疗直结肠癌中作为治疗靶点的应用。本专利技术设计的shRPL6分子能显著降低HCT116肿瘤细胞内RPL6的表达水平，高效抑制体外培养的HCT116细胞增殖速率。因此，本专利技术设计的shRPL6分子具有治疗结直肠癌的潜能。本专利技术设计并合成了一种针对RPL6的shRNA分子，该分子能显著降低结直肠癌细胞HCT116的生长速率，对于恶性肿瘤的治疗具有十分重要的意义，将该shRNA分子进一步开发成为临床治疗药物，具有广泛的市场应用前景，其潜在的社会和经济效益必将十分巨大。附图说明图1为荧光定量PCR检测结果图。图2为免疫印迹法检测结果图。图3为MTT法检测shRPL6影响HCT116肿瘤细胞增殖的结果图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护权限不限于下述的实施例。实施例中所涉及材料的来源：TE缓冲液(pH=本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种 RPL6-shRNA，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种RPL6-shRNA，其特征在于，其序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。


2.根据权利要求1所述一种RPL6-shRNA，其特征在于，所述RPL6-shRNA包含用于沉默人源RPL6基因的靶点序列。


3.根据权利要求2所述一种RPL6-shRNA，其特征在于，所述靶点序列为CAGAAAGCTGTGGACTCACAA，其对应编码区为748-768核苷酸位点。


4.根据权利要求3所述一种RPL6-shRNA，其特征在于，所述RPL6-shRNA包含正义链和反义链，所述正义链的寡核苷酸序列为：
5’-CCGGCAGAAAGCTGTGGACTCACAACTCGAGTTGTGAGTCCACAGCTTTCTGTTTTTGGATCC-3’；所述反义链的寡核苷酸序列为：
5’-AATTGGATCCAAAAACAGAAAGCTGTGGACTCAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新跃，刘雅娴，丁笠，张智萍，张杰，陈磊，何妍之，聂也森，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32