本发明专利技术一个方面涉及检测急性博尔纳病病毒(BDV)感染的方法。根据本发明专利技术，样品中p24 BDV磷蛋白和p40 BDV核蛋白的异二聚体的存在使用夹心ELISA通过这两种蛋白的抗体确定。本发明专利技术还涉及用于检测急性BDV感染的夹心ELISA的诊断试剂盒。所述试剂盒使用p24 BDV磷蛋白的一抗和p40 BDV核蛋白的第二一抗，至少一种报道分子标记的二抗，将一抗固定在表面的手段，以及进行根据本发明专利技术的方法的说明书。本发明专利技术还涉及根据本发明专利技术的方法和新诊断试剂盒与已知检测循环免疫复合物(CIC)的方法和抗体的组合。因此区分急性BDV感染与慢性和潜伏性BDV感染(人和动物)，例如允许对于患病个体的鉴别诊断和治疗监测以及根据健康携带者的感染状态鉴定健康风险。
Methods and diagnostic kits for the detection of acute Borna disease virus (BDV) infection, especially for the combination of acute, chronic and latent BDV infection
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测急性博尔纳病病毒(BDV)感染的方法及其诊断试剂盒，特别是组合区分急性及慢性和潜伏性BDV感染的方法及其诊断试剂盒专利
第一方面，本专利技术涉及一种用于检测急性博尔纳病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)感染的方法。根据本专利技术，这包括通过夹心ELISA确定样品中由p24BDV磷蛋白和p40BDV核蛋白组成的异二聚体的存在。这种确定包括使用针对p24BDV磷蛋白和针对p40BDV核蛋白的特异性一抗。第二方面，本专利技术提供了用于检测急性BDV感染的夹心ELISA的诊断试剂盒。所述诊断试剂盒包含第一一抗和第二一抗，其中这些一抗之一针对p24BDV磷蛋白，而另一个一抗针对p40BDV核蛋白，以及包含用报道分子标记的至少一个二抗，将一抗固定在表面上的手段以及实施本专利技术方法的说明书。第三方面，本专利技术涉及区分急性BDV感染与慢性和潜伏性感染，通过首先将本专利技术的方法和由此提供的诊断试剂盒与检测BDV感染的方法组合，其中由BDV抗原和与其附着的特异性抗体组成的游离循环免疫复合物(CIC)通过免疫学测定进行检测，例如DE19758017C2所述，其次另外使用检测BDV感染的方法，其中感染的宿主中游离循环BDV抗体通过免疫学测定进行检测。因此，根据本专利技术的诊断试剂盒包括用于检测BDVCIC的手段和用于检测BDV抗体的合适的诊断试剂盒。最后，本专利技术提供了根据本专利技术的方法在诊断急性BDV感染和/或病程监测中的应用。特别是与检测BDVCIC和BDV抗体的方法组合，根据本专利技术的方法可用于区分急性BDV感染与慢性和潜伏感染和/或病程监测以及排除BDV感染。其同样适用于人和动物。感染的状态和感染的过程直接影响对临床患病个体进行抗病毒治疗的可能性。
技术介绍
博尔纳病病毒(BDV)在分类学上是“博纳病毒科”(Bornaviridae)病毒中物种“哺乳动物1博尔纳病毒种”(Mammalian1bornavirus)的引导病毒，属于“单股反链病毒目”(Mononegavirales)。其病毒株从遗传学角度具有95％以上相同度，在人和许多哺乳动物中感染脑和血细胞并在世界范围内广泛传播。就马而言，其是博尔纳病的病原体。博尔纳病毒是包膜病毒(直径90nm)，含8910千碱基的负义非节段化单链(NSS)RNA，其编码6个基因。博尔纳病毒在宿主细胞的核中繁殖，是进化上最古老的病毒之一，其与灵长类祖先共存了至少4000万年，就其遗传物质而言甚至在人类身上也留下了永久痕迹。如今，BDV感染发生在许多农场和家畜(包括马，绵羊，牛，猫)和人类中。其终生保留在被感染的生物体中(持续感染而无细胞破坏)，优先影响就进化而言更老的大脑部分(边缘系统)并参与行为和情绪变化。据推测德国三分之一的成年人感染了未被注意的博尔纳病毒，即没有临床症状(BodeandLudwig,2003)。对于每六分之一的感染个体(16-17％)，一生中遭受精神障碍的风险增加。基于总人口，每二十分之一的人(每100人中有5人；5％)患病的风险增加。猜测最重要的危险因素是长期压力，其会长期削弱免疫系统并有利于潜伏的博尔纳病毒的激活。博尔纳病毒优先影响大脑边缘系统的神经细胞。这些大脑中枢区域控制行为和情绪并参与学习过程和记忆形成。这种病毒主要在神经细胞中繁殖并可以通过其过程而扩散到整个神经系统。这涉及病毒蛋白N(p40核蛋白)和P(p24磷蛋白)(抗原)的过量形成。在有症状患者的大脑中(例如在抑郁症的情况下)，其会导致大脑信使物质平衡失调(经动物实验证实)。在动物中，BDV感染与情景行为障碍有关，包括冷漠、注意力丧失和运动协调障碍。在人类中，发现急性或慢性博尔纳病毒感染在急性抑郁发作、强迫症和慢性疲劳综合症中与例如健康人相比更频繁发生。因此，多年来一直猜测博尔纳病毒参与了非常复杂的疾病过程，但这仍然被认为是有争议的(BodeandLudwig,2003)。金刚烷胺的抗病毒治疗已被证实与此有关。内因性复发性抑郁症(单相或双相)，在德国和世界范围内的主要精神疾病中，一生患病率至少为5％。因此，需要一种可靠的诊断系统以捕获BDV感染，既可以用于监测患病个体的感染阶段，也可以用于病程和治疗监测，以及基于流行病学原因在人群基础上捕获未被发现感染的无症状携带者，或在个人基础上确定个人患病风险。为了评估感染阶段(急性，慢性，潜伏期)，已发现血液中BDV抗原(N和P)的表达增加是关键的活动参数。其与(人和动物)临床疾病具有很好的相关性，可定量测量且对于估计临床过程很重要。抗原的确定不能代之以通过巢式RT-PCR或实时RT-PCR扩增检测PBMC中的病毒核酸，因为这只能确定病毒本身，而不能确定其活性。如今，在许多地方都通过检测病毒基因组来诊断博尔纳病毒感染，或者在血清学上限于通过各种血清学方法检测抗体。但是，单独阴性检测特异性抗体并不是排除BDV感染的合适方法，因为游离抗体在抗原释放繁殖阶段以被感染个体血清中循环免疫复合物(CIC)的形式结合并可以暂时降至检测极限以下。近年来，已经进行了基于ELISA技术的诊断方法，其中测量了BDV特异性免疫复合物(CIC)以及病毒蛋白和可能的游离循环抗体(Bodeetal.,2001)。在这种情况中使用特异性单克隆抗体。自1994年对两个BDV病毒株的前两个完整基因组进行测序以来，BDV核蛋白p40和磷蛋白p24的氨基酸序列已为人所知(Brieseetal.,1994；Cubittetal.,1994)。对于核蛋白，可以创建三维结构的带状模型(Rudolphetal.,2003)。BDVELISA测定的关键试剂，单克隆抗体W1(抗N)和Kfu2(抗P)，以其基本特性鉴定(Ludwigetal.,1993)。BDVCIC是可最常检测的感染标志物，迄今为止已被发现对于相应的诊断测定是最佳的。基于此，DE19758017C2涉及检测BDV感染的相应方法，其中通过免疫测定法检测由BDV抗原和与其附着的特异性抗体组成的游离循环免疫复合物。如起始所述，这个产权还涉及相应的诊断试剂盒。在DE19860255C2中找到其扩展，涉及检测BDV感染的方法，其中抗原检测是在血浆样品、脑脊髓液或尿液中进行。使用针对BDVCIC的相应血液检测。免疫复合物(CIC)仅在病毒繁殖阶段才可检测到，使用CIC非常适合在阳性病例中指示慢性感染。其它早期抗原测定表明在阳性病例的发作。阴性CIC测定需要额外的抗体ELISA以检测潜伏感染或排除感染。当前诊断系统和方法基于CIC检测，其中基于夹心ELISA，使用来自第一物种的单克隆抗体结合CIC中的抗原部分，然后使用另一物种的酶标记二级抗抗体和相应于样品中CIC相对量的底物反应(颜色变化)检测结合的CIC的抗体部分。已证实CICELISA是检测慢性BDV感染的有效基础测定。对于急性BDV感染检测(这在临床上对个体而言尤其重要)，单独进行这个测定是不合适的。迄今为止，抗原测定受制于高样品量和有限资源，因此从长远来看不能用作诊断试剂盒。本专利技术通过提供一种用于急性BDV感染的全新本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测急性博尔纳病病毒(BDV)感染的方法，包括通过夹心ELISA确定样品中由p24 BDV磷蛋白和p40 BDV核蛋白组成的异二聚体的存在的步骤，第一一抗以固定化状态存在，在将所述样品与所述固定化第一抗体温育后，第二一抗以非固定化状态加入，特征在于所述第一一抗针对p24 BDV磷蛋白而所述第二一抗针对p40 BDV核蛋白，或反之。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170912 DE 102017121046.61.一种用于检测急性博尔纳病病毒(BDV)感染的方法，包括通过夹心ELISA确定样品中由p24BDV磷蛋白和p40BDV核蛋白组成的异二聚体的存在的步骤，第一一抗以固定化状态存在，在将所述样品与所述固定化第一抗体温育后，第二一抗以非固定化状态加入，特征在于所述第一一抗针对p24BDV磷蛋白而所述第二一抗针对p40BDV核蛋白，或反之。
2.权利要求1所述的方法，特征在于所述一抗之一针对磷酸化的p24BDV磷蛋白而所述第二一抗针对p40BDV核蛋白表位，特别是在BDV核蛋白上与BDV磷蛋白结合结构域不重叠的那些表位，以确定由p24BDV磷蛋白和p40BDV核蛋白组成的p24磷酸化异二聚体。
3.前述权利要求任一项所述的方法，特征在于所述固定化一抗通过第一二抗以固定化状态存在于表面上或已经直接固定化在所述表面上。
4.前述权利要求任一项所述的方法，特征在于所述非固定化第二一抗通过包含报道分子的第二二抗测定。
5.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述第一一抗和第二一抗源自不同物种和/或其中所述一抗是单克隆抗体。
6.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述一抗源自相同物种，但是属于不同免疫球蛋白类别或不同免疫球蛋白亚类，特别是其中第一一抗是源自亚类IgG1的小鼠的单克隆抗体以及所述第二一抗是源自亚类IgG2的小鼠的抗体，或反之。
7.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述二抗来自不同物种或源自相同物种。
8.前述权利要求任一项所述的方法，特征在于另外检测了由BDV抗原，特别是p24蛋白和/或p40蛋白，以及与其附着的特异性抗体组成的循环免疫复合物(CIC)。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于另外检测了针对p24蛋白和/或p40蛋白的循环游离抗体，特别是针对磷酸化p24蛋白和针对p40蛋白的循环游离抗体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：H·路德维希，L·博德，
申请(专利权)人：H·路德维希，L·博德，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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