本发明专利技术公布了一种汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，具体包括汉坦病毒巢式PCR第一轮（RT-PCR）及巢式PCR第二轮（汉城型和汉滩型）反应体系及反应条件，本发明专利技术将汉坦病毒核酸检测所需的酶Enzyme Mix或DNA Polymerase、反应缓冲液2×Buffer或10×PCR Buffer、核苷酸4×dNTP、RT-PCR及PCR（汉城型及汉滩型）所需引物HTV－MFO、HTV－MRO、SEO-MF、SEO-MR、HMF及HMR分别整合到200 µL PCR反应管中，通过真空干燥处理形成集成式RT-PCR（PCR）反应管。本发明专利技术具有敏感性高、特异性强、稳定性好等特点。应用本发明专利技术的汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒对鼠类等样品进行检测，明显缩短检测周期、简化工作程序、减轻工作量、降低成本、方便用户使用。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】
本专利技术属于生物技术检测领域，特别涉及汉坦病毒核酸检测试剂盒。
技术介绍
虫媒病是一类重要的传染病。近20年来，全球新发现的30多种传染病中，许多是 由病媒生物传播的。目前我国法定的传染病有36种，其中鼠疫、肾综合征出血热、疟疾、登 革热与登革出血热等13种疾病为虫媒病。这类疾病在我国每年传染病总发病病例中约占 5%-10%，死亡数占传染病总死亡数的30%-40%。 汉坦病毒（Hantavirus)是引起肾综合征出血热（HFRS)和汉坦病毒肺综合征 (HPS)的病原体，属布尼亚病毒科（Bunyaviridae)汉坦病毒属（Hantavirus)单股负链RNA 病毒。目前，全球已有40多种不同分型的汉坦病毒，其中22个型的汉坦病毒可引起人类疾 病。汉滩型汉坦病毒（HTNV)和汉城型汉坦病毒（SEOV)是引起我国HFRS的主要病原体，啮 齿动物是汉坦病毒的主要宿主。 近半个世纪以来，肾综合征出血热严重危害我国人民健康和生命安全。20世纪50 年代共发生3568例、60年代23164例、70年代143949例、80年代696074例、90年代488330 例。病死率从1980年的6. 4%降至1993年的1.6%。该病至今仍在我国东北及环渤海地区 广泛流行，尚无特殊的治疗方法及特效药。 随着国际贸易和旅游业的发展，病媒生物及其携带的病原体可借助交通工具、集 装箱、货物等在国际间传播。使原本局限于一定地域内的虫媒病突破国境或自然地理的界 限，在全球范围内广泛传播与流行，对输入国的卫生安全特别是口岸地区的卫生安全造成 极大的威胁。 鼠类是出入境交通工具中常见的媒介生物之一，可随飞机、轮船等载体在国境口 岸之间扩散。历史上多次发生由于鼠类入境造成疫病暴发流行的事例。1898年，一艘汽船 将染有鼠疫耶尔森菌的褐家鼠 （Rattus norvegicus)从印度带到了马达加斯加岛，褐家鼠 在该岛大量繁殖，使当地鼠疫频繁发生。近年来，我国卫生检疫机构在北京、上海、宁波、成 都等口岸的入境飞机、轮船、集装箱中查获大量的鼠类。鼠类的输入对我国国境口岸的卫 生安全构成严重威胁。 加强对啮齿动物等，尤其是输入性鼠类进行汉坦病毒检测是对汉坦病毒进行预 防、控制的基础和前提，汉坦病毒检测方法主要有血清学检测和核酸检测，血清学检测主要 有免疫荧光测定（IFA)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、免疫层析试纸条等。随着分子生物学 技术的不断发展，核酸检测技术被越来越多的应用到病原检测中来，该技术具有较高的敏 感性，尤其适合于病毒载量低的样品。 核酸检测主要包括引物设计、反应体系和反应条件优化、核酸扩增、电泳凝胶检测 和结果分析等。如果没有预先的储备，一名熟练的实验室工作人员从接收样品到准备、检测 和分析，需一周左右的时间。如果无法及时获取阳性样品对反应组成、反应条件进行探索， 上述时间将明显延迟或根本进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决汉坦病毒检验检疫问题，提供一种汉坦病毒集成式核酸检测 试剂盒，试剂盒简单实用，特异性强，敏高性高，使用者只需将处理后的样品加入反应管中， 即可进行扩增反应。 本专利技术汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，包括汉坦病毒巢式PCR第一轮及巢式 PCR第二轮反应体系，其中PCR第一轮反应体系包括一对通用引物HTV - MFO、HTV - MRO ; PCR第二轮反应体系包括汉城型引物SEO-MF、SEO-MR和汉滩型PCR引物HMF、HMR，引物序列 如下：所述PCT第一轮为RT-PCR反应体系，总体积为50 μL，包括Enzyme Mix 2.0 μL， 2XBuffer 25.0 μL，模板 RNA 2-14 μL，引物 HTV -MFO (20 μΜ) 2.0 μL，引物 HTV -MRO (20 μΜ) 2.0 μL，补充 RNase Free H2O 使总体积达到 50 μι; 所述PCR第二轮汉城型反应体系总体积为50 μL，包括DNA Polymerase (IU/ μ 1) 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 PL，4XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL (RT-PCR)，引物 SEO-MF (2〇μΜ) 2· 0 μL，引物 SEO-MR (20 μΜ) 2.0 μL，补充 ddH20 30.0 μL，使总体积达到 50 ? ； 所述PCR第二轮汉滩型反应体系总体积为50 μL，包括DNA Polymerase (lU/μυ 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 μL，4XdNTP 5.0 μL，模板4.0 μL，引物HMF (2〇μΜ) 2.0 μL，弓丨 物 HMR (2〇μΜ)2·0 μL，补充 ddH20 30.0 μL，使总体积达到 50 μL。 本专利技术汉坦病毒集成式核酸检测方法， (1)汉坦病毒核酸检测引物的设计与合成：以汉坦病毒M片段设计并合成RT-PCR通用 外引物HTV - MFO、HTV - MRO，扩增片段大小为445 bp ;汉城型PCR引物SEO-MF、SE〇-MR，扩 增片段大小为417 bp;汉滩型PCR引物HMF、HMR，扩增片段大小为382 bp，引物序列如下：(2) PCR反应体系的建立： RT-PCR 反应体系为 50 μL，包括 Enzyme Mix 2.0 μL，2XBuffer 25.0 μL，模板 RNA 2-14 μL，引物 HTV -MFO (20 μΜ) 2.0 μL，引物 HTV -MRO (20 μΜ)2·0 μL，补充 RNase Free H2O使总体积达到50 μL ;将RT-PCR反应体系的混合液，模板RNA除外，分装至200 μL PCR管中并置于冰箱中，-20 °C及以下冷冻3 h以上，将PCR管置于冻干机内进行真空干燥 处理3h，保存于-20°C冰箱中待用； PCR第二轮汉城型反应体系为50 μL，包括DNA Polymerase (1U/μ 1) 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 PL，4XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL (RT-PCR)，引物 SE0-MF(2(^M)2.0 μL，引物 SEO-MR (20 μΜ) 2.0 μL，补充ddH20 30. 0 μL，使总体积达到50 μι;将PCR第二轮汉城型反 应体系的混合液，模板除外，分装至200 PL PCR管中并置于冰箱中，-20 °C及以下冷冻3 h 以上，将PCR管置于冻干机内进行真空干燥处理3h，保存于-20°C冰箱中待用； PCR第二轮(汉滩型）反应体系为50 μL，包括DNA Polymerase (lU/μυ 2.0 μL， 10XPCR Buffer 5.0 μL，4 XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL，引物 HMF (20ΜΜ) 2.0 μL，引物 HMR (2〇μΜ)2. 0 μL，补充CldH2O 30. 0 μL，使总体积达到50 μι;将PCR第二轮汉滩型反应体系的 混合液，模板除外，分装至200 PL PCR管中并置于冰箱中，-20 °C及以下冷冻3 h以上，将 PCR管置于冻干机内进行真空干燥处理3h，保存于-20°C冰箱中待用； (本文档来自技高网...
【技术保护点】
汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，其特征是：包括汉坦病毒巢式PCR第一轮及巢式PCR第二轮反应体系，其中PCR第一轮反应体系包括一对通用引物HTV－MFO、HTV－MRO；PCR第二轮反应体系包括汉城型引物SEO‑MF、SEO‑MR和汉滩型PCR引物HMF、HMR，引物序列如下：。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋锋林，高玉峰，程晓兰，姜陆，万雪，
申请(专利权)人：宋锋林，高玉峰，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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