本发明专利技术公布了一种莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法及检测体系，检测体系由引物、探针、TaqMan mix buffer、ddH2O、pMD18-T-Rm、pMD18-T-Ot组成。引物包括Pr47F、Pr47 R、Ot-F、Ot-R，探针包括Probe-P、Probe-O。该引物和探针具有特异性好、敏感性高等特点，该检测方法与普氏立克次体、立氏立克次体、Q热立克次体等均无交叉反应；可同时检测到8.24个拷贝的莫氏立克次体标准品和43.6个拷贝的恙虫病东方体标准品。本发明专利技术可同时对莫氏立克次体及恙虫病东方体进行检测，适合国境口岸卫生检疫部门开展对上述病原体的监测检测工作。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测 体系及检测方法
本专利技术属于生物技术检测领域，特别涉及实时荧光定量PCR检测方法及检测体 系，可同时对莫氏立克次体和恙虫病东方体进行核酸检测。
技术介绍
虫媒病是一类重要的传染病，在我国每年传染病总发病病例中约占 5 %~10 %，死 亡病例数占传染病总死亡数的30 %~40 %。目前，虫媒病流行和爆发呈现出新趋势：原有 虫媒病再度爆发，流行区域不断扩展；新发虫媒病不断被发现，且流行范围在不断扩大；虫 媒病流行的频率不断加大。 鼠型斑疹伤寒（Murine Typhus)是由莫氏立克次体（yPicAeiteia a?oase>_ri)经鼠、 蚤等媒介生物传播的自然疫源性疾病；恙虫病（Tsutsugamushi Disease)又称丛林斑疹伤 寒，是由恙虫病东方体（iia tew 邮引起的自然疫源性疾病。莫氏立克次体 和恙虫病东方体均以鼠类为主要传染源。 鼠型斑疹伤寒及恙虫病在我国许多地区均有流行，如鼠型斑疹伤寒在我国东北、 上海及长沙等地均有流行。我国目前有港口、机场、车站及陆路边境口岸约400个，每年均 有大量媒介生物借助交通工具、集装箱及货物等在口岸间输入输出。仅2002年到2007年 的五年间，卫生检疫机构就在入境交通工具、集装箱、货物中共捕获各类病媒生物1. 8亿多 只，且捕获数量呈现逐年上升的趋势。大量媒介生物的输入对我国的卫生安全特别是口岸 地区的卫生安全造成极大的威胁。强化对出入境交通工具及集装箱、货物等的排查和对输 入性医学媒介生物携带病原体的检测，是有效防止虫媒传染病通过国境口岸输入、输出，避 免疫情大范围爆发的基础和前提，也是国境口岸检疫执法和疾病监测的迫切需要。 在样品检测过程中，因样品感染情况、操作者技术水平等因素影响，传统检测方法 往往具有一定的局限性。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR技术被广泛 应用到医学和生物学领域，该技术具有灵敏度高、特异性好和可靠性强等特点，而且能够实 现多重反应，自动化程度高。TaqMan技术是一种对单管PCR产物进行实时荧光定量检测的 技术，通过加入与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号的积累来实时监 测整个PCR进程，从而对靶标基因进行定量或定性检测。与常规TaqMan探针相比，美国应 用公司推出的TaqMan-MGB探针技术不仅荧光本底得以降低，荧光光谱分辨率得以改善，由 于探针3'端结合了 Minor groove binder结合物，使得探针的Tm值得以提高，同时提高了 探针的杂交稳定性和特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决同时检测莫氏立克次体及恙虫病东方体的问题，提供了莫氏 立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，包括引物和TaqMan-MGB探针序 列，特异性强，敏高性高；另外，本专利技术还提供一种莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时 荧光定量PCR检测方法，PCR反应体系和反应条件，特异性强，敏高性高，且具有良好的重复 性。 本专利技术莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，包括莫氏 立克次体和恙虫病东方体的引物和探针，其中， 莫氏立克次体引物及Taqman-MGB探针序列： 本专利技术莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法： (1)首先是引物及探针的设计与合成： 以GenBank公布的莫氏立克次体基因序列（GI :51459527)的ompB蛋白基因序列设计 并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为64bp， Pr47F :5' -TGTTGATGGTGCAGGATTTGA -3' Pr47R:5' -CGAATTTGTAGCGACAGGAAG A -3' Probe-P :5' - FAM - CAAACTGGCGCTGGTGT -3' ； 以GenBank公布的恙虫病东方体Karp型基因序列（GI: 63079111 )，56-kDa蛋白基因序 列设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为130bp， Ot-F :5' -TCT RCR CCAGTAATYATTCCTCC-3' R=A/G Y=T/C Ot-R :5' -TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3' Probe-0 :5' -HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3' ； (2) 阳性对照样品的合成： 莫氏立克次体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的莫氏立克次体基 因序列（GI: 51459527)，选取莫氏立克次体引物扩增区域核酸序列（120 bp)，委托宝生物 工程(大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为莫氏立克次体阳性对照样品，命名为 pMD18-T-Rm，合成序列如下：恙虫病东方体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的恙虫病东方体基 因序列（61:63079111)，选取恙虫病东方体引物扩增区域核酸序列（153匕？），委托宝生物 工程(大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，命名为 pMD18-T-〇t，合成序列如下：(3) PCR反应体系的建立：莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体 系的建立，以循环阈值和荧光强度等作为评价指标，通过四因素三水平正交试验（L3 4)优化 PCR反应体系中莫氏立克次体引物（Pr47F/R)和探针（Probe-P)浓度及恙虫病东方体引物 (Ot-F/R)和探针（Probe-Ο)浓度等，建立最佳PCR反应体系如下：(4) 实时荧光定量PCR反应条件优化：通过优化退火温度，最佳PCR反应条件如下： 50 0C 2min ；95〇C IOmin ；95〇C 15s，60°C lmin，循环45次，退火时收集荧光信号。 (5)对所述的莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体系和反 应条件进行评价，包括敏感性评价、特异性评价及重复性评价。 所述的敏感性评价方法及结果如下： 分别以制备的pMD18-T-Rm标准品、pMD18-T-〇t标准品为模板，进行多重定量PCR扩增 反应，FAM通道和HEX通道均可获得较为理想的扩增曲线，以Ig (浓度）为横坐标，以循环 阈值Ct值为纵坐标，以IO2-IO7标准品测试结果绘制定量关系曲线； 以pMD18-T-Rm标准品和pMD18-T-〇t标准品的混合物为模板进行进行多重定量PCR扩 增反应，FAM通道和HEX通道均获得较为理想的扩增曲线。 所述的特异性评价方法及结果如下： 以普氏立克次体、立氏立克次体、Q热立克次体、噬吞噬细胞无形体及伯氏疏螺旋体等 病原体DNA为模板，同时以ddH20、莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA及 莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA、pMD18-T-Rm和pMD18-T-〇t的混合 物作为空白对照、阴性对照及阳性对照进行多重定量PCR扩增，通过FAM通道和HEX通道分 析。 所述的重复平评价方法及结果如下： 以同一批次制备的IO6个拷贝的pMD18-T-Rm的标准品和pMD18-T-〇t的标准品的混合 物做为模板进行定量PCR扩增，FAM通道本文档来自技高网...
【技术保护点】
莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，其特征是：包括莫氏立克次体和恙虫病东方体的引物和探针，其中，莫氏立克次体引物及Taqman‑MGB探针序列：上游引物Pr47F：5’‑TGTTGATGGTGCAGGATTTGA ‑3’下游引物Pr47R：5’‑CGAATTTGTAGCGACAGGAAG A ‑3’探针Probe‑P：5’‑ FAM ‑ CAAACTGGCGCTGGTGT ‑3’恙虫病东方体引物及Taqman‑MGB探针序列：上游引物Ot‑F：5’‑TCT RCR CCAGTAATYATTCCTCC‑3’ R=A/G Y=T/C下游引物Ot‑R：5’‑TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC‑3’探针Probe‑O：5’‑HEX‑AAGGACCACACTCTAAT‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高玉峰，宋锋林，万雪，程晓兰，姜陆，
申请(专利权)人：宋锋林，高玉峰，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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