一种检测汉坦病毒基因组的ＲＴ－ＰＣＲ法制造技术

本发明专利技术公开了一种检测汉坦病毒株基因组的方法，其步骤是：Ａ、设计两对汉坦病毒通用引物；Ｂ、汉坦病毒检测的方法：ａ．用病毒特异性ＲＮＡ提取试剂盒提取标本血清总ＲＮＡ；ｂ．核酸分析仪检测ＲＮＡ含量，取ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ反应；ｃ．ＲＴ－ＰＣＲ：ＲＴ使用ＨＶ属特异性引物Ｐ↓［０］，ＰＣＲ使用ＨＶ通用引物Ｐ↓［１］／Ｐ↓［２］，Ｐ↓［３］／Ｐ↓［４］；ｄ．琼脂糖凝胶电泳观察病毒核酸扩增结果，出现－特异性核酸带。本发明专利技术直观优越，敏感性好，效果良好，近１０年血清的检出率为７９．２％，２０年前血清的检出率仍可高达７０．５％，适用于汉坦病毒感染的实验室检测和分子流行病学调查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到病毒检测领域，具体涉及一种检测汉坦病毒(HV)基因组的 方法，包括设计了两对新型汉坦病毒通用引物，研究了实验条件，建立了病毒基 因组的RT-PCR方法，并对不同年代汉坦病毒血清标本进行了检测。
技术介绍
病毒性疾病是一类严重威胁人类健康的传染性疾病，85%以上的传染性疾病 由病毒引起，重要病毒危害到国家安全和社会发展。汉坦病毒(Hantaviruses, HV) 是肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndromes, HFRS)和汉坦病毒 月巿综合征(hantavirus pulmonary syndrome, HPS)的病原体，人可通过气溶胶吸 入、伤口、消化道等途径感染，被世界卫生组织列为可通过气溶胶传播的生物武 器。HFRS/HPS的主要特征是发热、出血肾损害和呼吸衰竭。我国是受汉坦病毒 危害最为严重的国家，HFRS患者占世界的90Q/。以上。HFRS是经啮齿类动物传 播的急性自然疫源性疾病。HFRS疫区已扩大到全国31个省市，同时疫区类型 亦发生改变，80年代前为汉滩型(HTN型)疫区，之后又出现汉城型(SEO型) 且两型并存，2003年又报道有普马拉型(PUU型)出现。HV是分节段的负单 链RNA病毒，由L、 M、 S三个片段组成，分别编码RNA聚合酶、外膜糖蛋白 (G蛋白，GP1&GP2)和衣壳核蛋白。常规的诊断检测方法包括病毒的分离鉴定、ELISA法检测血清中抗HV IgM、 IgG抗体，IFA法检测病毒抗原和抗体，核酸分子杂交检测病毒基因组等。但经 典的分离鉴定法费时，IFA法也不适用于快速的现场检测，检测HV抗体仅是一 个侧面的间接指标，用PCR法检测组织和细胞中HVRNA已有报道，并认为这 一方法直观优越，但阳性率低，检测保存时间久的血清中病毒RNA的研究也未 见报道。为了提高血清中HV的检出率和准确性，本专利技术设计了两对新引物，建立了一种检测血清中病毒RNA的新方法，用于不同时期血清标本的检测，并得 到了优势株病毒基因组。国内外尚未见此新型汉坦病毒通用引物的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种检测汉坦病毒基因组的方法，涉及到所提供 RT-PCR的方法在检测血清样本中HV基因组的应用。该法直观优越、敏感性好、 特异性高，对检测微量、保存时间久的标本中汉坦病毒基因组的效果良好，可用 于汉坦病毒感染的实验室检测和HRFS/HPS的分子流行病学调查。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案A、设计两对新型汉坦病毒通用引物本专利技术中所设计的两对新型汉坦病毒通用引物，从GenBank中获得HTV 76-118、 HTV 84Fli 、 HTV CUMC 、 HTV HoJo 、 HTV HV114 、 HTV Lee 、 HTV NC167 、 SEOBiken-l、 SEO HR80-39、 SEO KI-83-262、 SEOKI-85-l、 SEOKI-88-15、 SEO L99、 SEO R22、 SEO SR-ll共15株汉坦病毒基因编码氨基酸序列和cDNA序列。 将所有氨基酸序列和cDNA序列输入DNASTAR MegAlign软件用Clustal W程 序排列，寻找氨基酸序列及对应cDNA序列均保守区域作为引物设计区(见表1)。 国内外尚未见此新型汉坦病毒通用引物设计的研究报道。表l 汉坦病毒引物设计引物序列(5'-3')位置极性温度(°c)长度(bp)p1GATTGAAGATATTGA921-941+p2GTCACC GTTGTATCCCCATTGA TTGTG、1142-1162-50.1-50.5242p3TGAGAAATGTGTATG96-116+p4ACATGA ACTAGACACTGTTTC AAATGA323-343-49.1-49.9248B、汉坦病毒基因组检测的方法a、 用病毒特异性RNA提取试剂盒(Promega公司病毒基因组RNAKit) 提取标本血清总RNA;b、 核酸分析仪检测RNA含量，所有标本RNAOD260/280^1.9，后取50ng RNA进行RT-PCR反应；c、 RT-PCR: RT使用HV属特异性引物Po ( 5'—ATGCAATATGATGAAAAG -3')，其反应条件为37。C反应60min， 93°C 5min终止反应，迅速置冰上冷却 3min; PCR使用技术方案A中设计的新型HV通用引物(P,/P2， P3/P4)，其反应 条件为94°C预变性3min， 94°C变性lmin， 50°C复性lmin， 72°C延伸lmin， 循环35次，最后72°C延伸5min;d、 1.5%琼脂糖凝胶电泳观察病毒核酸扩增结果，在250bp处出现一条特异 性核酸带。为保证各种亚型HV RNA都能有效地逆转录为cDNA，本研究选用了 HV 属特异性引物Po为共同引物，P卜P2引物的设计参照相应的病毒核酸序列。为 了增强引物的属特异性，申请人在引物Pi的5'端添加了 2个碱基。同时考虑到 目的基因序列越长，其扩增的敏感性越低，故引物设计时选择了扩增200-300bp 短片段的引物，以增加HVRNA检测的阳性率。为了能进一步增加本法检测HVRNA的敏感性，以用于标本年限跨度比较大 的血清标本的研究，因而高效完整地提取RNA是进行RT-PCR反应成功的关键。 由于HVRNA极易因为长时间保存而发生降解，且因HV感染后呈一过性病毒血 症导致血液标本中的HVRNA含量少，因此，申请人在提取RNA试剂的选择上， 选用了专门从液体标本中提取RNA的总RNA提取试剂盒(Promega公司病毒基 因组RNA Kit)，该试剂盒基于离子吸附原理可有效地提取液体标本中的总 RNA，去除DNA和蛋白质污染；同时又因具备无需低温操作、离心时间短等优 点可尽量减少RNA降解和破坏，得到高品质的RNA样品。另外，申请人选用了 针对陈旧性标本中RNA含量少，进行逆转录的Sensiscript逆转录酶，该酶能将少 于50ng的总RNA高效逆转录为cDNA，且具有RNaseH活性，能降解RNA:DNA杂 合子中的RNA，为PCR反应提供纯品的cDNA模板。本专利技术与现有技术相比，具有下列优点1、 本专利技术中所设计的两对新型HV引物针对HV保守序列设计，可扩增出各 种型别的汉坦病毒，阳性检出率高，适用于临床检测未知型别的HV样本。2、 本专利技术中所设计的两对新型HV通用引物片段较短，灵敏度高，减少了 HV检测假阴性的可能。3、 本专利技术中所设计的HV通用引物P1在其5'端添加了2个碱基，增加了检测 的属特异性，减少了假阳性的可能。4、 本专利技术中所确立的HV基因组检测方法，选用了专门针对微量RNA的RNA 提取试剂盒和Sensiscript逆转录酶，对年代久远、保存条件较差的HV RNA有亦 有良好的检测效果，对20多年前收集的血清依然有较高的检出率，可用于临床、 实验室检测以及流行病学研究。附图说明图1为本专利技术检测HV基因组的特异性对照图M-DNA Marker; l隱阴性对照；2~4- HV 76-118; 5—8-HV 114; 9-CBV3; 10-HSV-1; 11-ddH20对照。图2为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测汉坦病毒株基因组的方法，其步骤是：Ａ、设计两对汉坦病毒通用引物：ａ、ＨＶ　Ｐ１／Ｐ２上游引物为ＧＡＴＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＣ，下游引物为ＧＴＴＧＴＡＴＣＣＣＣＡＴＴＧＡＴＴＧＴＧ；ｂ、ＨＶＰ３／Ｐ４上游引物为ＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＡＴＧＡＣＡＴＧＡ，下游引物为ＡＣＴＡＧＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡ；Ｂ、汉坦病毒检测的方法：ａ、用病毒特异性ＲＮＡ提取试剂盒提取标本血清总ＲＮＡ；ｂ、核酸分析仪检测ＲＮＡ含量，所有标本ＲＮＡＯＤ２６０／２８０≥１．９，后取５０ｎｇＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ反应；ｃ、ＲＴ－ＰＣＲ：ＲＴ使用ＨＶ属特异性引物Ｐ↓［０］５’－ＡＴＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＧ－３’，　其反应条件为３７℃反应６０ｍｉｎ，９３℃５ｍｉｎ终止反应，置冰上冷却３ｍｉｎ；ＰＣＲ使用ＨＶ通用引物Ｐ↓［１］／Ｐ↓［２］，Ｐ↓［３］／Ｐ↓［４］，其反应条件为９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，循环３５次，最后７２℃延伸５ｍｉｎ；ｄ、１．５％琼脂糖凝胶电泳观察病毒核酸扩增结果，在２５０ｂｐ处出现一条特异性核酸带。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨占秋，李晴，陈文，刘婧，肖红，付萍，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]