一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于医学领域的新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，扩增nCoV2019的靶向干扰基因shRNA序列，所得产物与空干扰载体pSilencer经BamH I和Hind III酶切而构建干扰载体pSilencer‑shRNA，该干扰载体经感受态大肠杆菌DH5a扩增和shRNA插入正确性鉴定后，用Hind lII和EcoR I同时酶切pSilencer‑shRNA和空穿梭载体pDC312，构建穿梭载体pDC312‑shRNA，使其与腺病毒骨架质粒pBHGloxAEl共转染HEK293细胞，在胞内同源重组而获得重组腺病毒Ad‑shRNA，再经HEK293细胞多次扩增和纯化制备nCoV dsRNA疫苗，通过喷雾接种，重组腺病毒载体Ad将shRNA导入呼吸道上皮细胞并在细胞内合成dsRNA，继之特异性诱导同源的nCoV mRNA降解，产生抗nCoV2019的转录后基因沉默或RNA干扰。

A novel coronavirus pneumonia dsRNA vaccine preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法
本专利技术涉及一种用于传染病防治领域的新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，属于疫苗制备方法

技术介绍
人类冠状病毒(HcoV229E和HcoVOC43)可引起达30％的感冒。动物冠状病毒，如猪胃肠炎冠状病毒(TGEV)、小鼠肝炎冠状病毒(MHV)、鸟传染性气管炎冠状病毒(IBV)等可感染相应宿主的呼吸道、胃肠道、神经系统和肝脏，导致相应症状。冠状病毒的包膜呈花瓣形突起，使冠状病毒看起来像王冠(拉丁语，corona)，其核衣壳是可变的长螺旋形。冠状病毒的病毒粒子直径为60nm～140nm，球形，病毒基因组是27kb～32kb的单链正义RNA，是所有RNA病毒基因组中最大的。2003年冠状病毒的一个变种引起了严重急性呼吸综合征即非典(SARS)的爆发，SARS-CoV基因组大小为27～3lkb，有14个开放读码框(openreadingframe，ORF)和1个s2m模序(s2mmotif)。石正丽等报道从5名病人体内获得了基本一致的nCoV-2019全基因组，其中有79.5％的序列与SARS-CoV一致，通过对其保守的7个非结构蛋白进行对比，发现nCoV-2019属于SARSr-CoV的包膜RNA病毒。nCoV-2019含有5'非翻译区(UTR)、复制酶复合体(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR以及几个未知的非结构性开放式阅读框架。对于nCoV-2019的基因诊断(PCR)，目前中国疾病预防控制中心推荐了针对新型冠状病毒nCoV-2019的开放读码框1ab(ORF1ab)、核壳蛋白(nucleoprotein，N)基因区域的引物和探针序列，其中：Target1(ORF1ab)：正向引物(F)：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物(R)：为ACGATTGTGCATCAGCTGA；探针(P)：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。Target2(N)：正向引物(F)：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物(R)：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；荧光探针(P)：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'。nCoV-2019全基因组序列和功能的分析(ANovelCoronavirusfromPatientswithPneumoniainChina,2019.TheNewEnglandJournalofMedicine,2020,January24)也为nCoV-2019的进一步研究奠定了良好的基础，但目前尚缺少有关nCoV-2019的更确切信息。国际流行病防范创新联盟(CEPI)首席执行官理查德·哈切特(RichardHatchett)于2020年1月23日表示，他所在的机构已首轮投资1500万美元进行新型冠状病毒疫苗的研制，若进展顺利，有望6个月后开始临床测试。2020年1月26日，中国疾病控制中心表示，该中心开始启动新型冠状病毒疫苗的研发，目前已经成功分离病毒，正在筛选种子毒株。2020年1月26日，浙江大学传染病诊治国家重点实验室李兰娟院士也表示分离到3株新型冠状病毒，为下一步的疫苗研究奠定了基础。疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、重组载体疫苗、病毒颗粒样疫苗和多肽疫苗等。传统疫苗多为死疫苗、减毒活疫苗或重组亚单位疫苗，而新型疫苗则为编码抗原蛋白的病毒核酸或能激发特异性免疫应答的细胞疫苗。现有的传统疫苗主要靠病原体的抗原蛋白刺激机体产生保护性抗体，现有的新型疫苗除此之外还能激发特异性细胞免疫应答。鉴于2019-nCoV的生物学特性还不太明了，传染性很强，应该注意到，活疫苗不具有安全性而且制备困难，灭活疫苗可能会与野毒株重组而回复，只宜作为应急储备。相比之下，基于现代生物技术的亚单位疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗的安全性、实用性和可操作性更强。为了减少疫苗运输、存放、接种的成本以及方便接种，常将数种不同病原体的疫苗混合在一起，称为多联疫苗，如百白破疫苗，一次接种可同时预防白喉、破伤风和百日咳。此外，为克服因毒株多型性而造成免疫效果差的缺点，常将针对同种病原体不同血清型的疫苗混合在一起，称为双价或多价疫苗，如多价HPV疫苗。但能否专利技术一种与抗原蛋白、抗体或细胞免疫无关的不同于现有疫苗的抗新型冠状病毒肺炎多价疫苗呢？本专利技术人拟尽早公开一种基于RNA干扰的新型冠状病毒双价疫苗的制备方法。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指某种小RNA可以与目的基因配对结合，特异性地剔除或关闭被结合基因的表达。即RNAi是指由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的同源mRNA的高效特异性降解。文献报道，1995年来自复旦大学的GuoShu博士在美国康奈尔大学将反义RNA注入秀丽新小杆线虫(C·ele-gans)体内，试图阻断par-1基因的表达。同时她还将正义RNA注入对照组线虫，以期观察到par-1基因表达增强的效果。然而对照组的par-1基因表达不仅未增强，反而与实验组一样被阻断。这种结果无法用传统的反义RNA技术做出解释，但她们还是将研究结果如实地投寄给了Cell杂志，并被发表。这一悬疑引起了华盛顿卡内基研究院FireA博士的注意，他采用凝胶电泳将正义RNA和反义RNA纯化，同时故意将纯化后的正、反义RNA混合在一起，制成dsRNA杂合体，分别注入线虫。结果发现纯化后的反义RNA基因阻抑作用显著减弱，而dsRNA杂合体却高效、特异地阻断了同源mRNA表达，其阻断作用超过反义RNA至少100倍以上。这一结果意外地证实了dsRNA在基因阻抑中发挥着重大作用。HreA将dsRNA的这一作用称为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)。1998年，HreA将研究结果发表于Nature杂志，以致迅速在全球掀起了RNA干扰研究的热潮，并证实RNA干扰是因dsRNA注入真核细胞后，激发真核细胞内防御反应，生成dsRNA诱导的沉默复合体，将与dsRNA具有同源序列的mRNA降解，导致基因在转录后水平沉默，丧失表达蛋白或多肽的能力。进一步的研究表明，病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶(Dicer)将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，扩增nCoV2019的靶向干扰基因shRNA序列，所得产物与空干扰载体pSilencer经BamH I和Hind III酶切而构建干扰载体pSilencer-shRNA，该干扰载体pSilencer-shRNA经感受态大肠杆菌DH5a扩增和shRNA插入正确性鉴定后，用HindlII和EcoRI酶切pSilencer-shRNA和空穿梭载体pDC312，构建穿梭载体pDC312-shRNA，使穿梭载体pDC312-shRNA与腺病毒骨架质粒pBHGloxAEl共转染HEK293细胞，在胞内同源重组而获得重组腺病毒Ad-shRNA，再经HEK293细胞多次扩增和纯化制备Ad-nCoV dsRNA疫苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，扩增nCoV2019的靶向干扰基因shRNA序列，所得产物与空干扰载体pSilencer经BamHI和HindIII酶切而构建干扰载体pSilencer-shRNA，该干扰载体pSilencer-shRNA经感受态大肠杆菌DH5a扩增和shRNA插入正确性鉴定后，用HindlII和EcoRI酶切pSilencer-shRNA和空穿梭载体pDC312，构建穿梭载体pDC312-shRNA，使穿梭载体pDC312-shRNA与腺病毒骨架质粒pBHGloxAEl共转染HEK293细胞，在胞内同源重组而获得重组腺病毒Ad-shRNA，再经HEK293细胞多次扩增和纯化制备Ad-nCoVdsRNA疫苗。


2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述靶向干扰基因shRNA序列指长度为19nt的与siRNA序列互补的RNA序列。


3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述靶向干扰基因shRNA序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，李兰娟，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33