一种制备环状RNA的方法技术

本发明专利技术属于核酸技术领域，具体涉及一种制备环状RNA的方法，主要解决线性RNA成环过程中存在的大分子聚合副产物随着底物浓度的增加而急剧增加，目的环状RNA产率低；并需要借助夹板链或辅助链，后期处理步骤繁琐的问题。针对要连接成环的线性RNA序列，先用Mfold或RNAstructure program等软件模拟成环后的二级结构，根据环状RNA的二级结构设计断开位点；以设计好的线性RNA为原料，采用T4RNA连接酶2(T4RNA Ligase 2)直接进行连接。连接过程中无需借助夹板链或辅助链，降低了后续纯化工艺的难度；成环的过程当中大分子副产物的产生被显著抑制，从而实现了目的环状RNA的高效制备。

A method of preparing circular RNA

【技术实现步骤摘要】
一种制备环状RNA的方法
本专利技术属于核酸
，具体涉及一种制备环状RNA的方法。
技术介绍
与线性RNA(L-RNA)相比，单链环状RNA(C-RNA)因无游离末端而对核酸外切酶具有较强抗性(J.Am.Chem.Soc.,2007,129,15108–15109；J.Biotechnol.,2009,139,265-272.)。环状RNA(circRNA)几乎在所有生物界中都有存在，相关研究表明其可作为miRNA或RNA抑制剂，还可被翻译，并具有调节其他蛋白质功能等诸多作用(Nature,2013,495,333-338；Nat.Rev.Genet.,2019,20,675-691.)。也有相关研究表明，哑铃形C-RNA可使活细胞中的siRNA寿命大大延长(Chem.Sci.,2018,9,44–51；Bioorg.Med.Chem.,2013,21,6198–6204.)。通过将siRNA中的反义RNA链环化并与线性的正义链相结合，可显著降低脱靶效应(Mol.Ther.Nucl.Acids,2017,10,237-244.)。核酶(R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备环状RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一，设计对T4 RNA连接酶2具有适当反应性的线性RNA底物，采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状RNA的二级结构，ΔG值＜0，模拟结果为结构①或结构②，所述结构①中间为凸环，凸环的两侧各有一个稳定的二级结构，凸环的长度为1-50nt；中间凸环两侧的稳定二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对，其余部分为任意长度的RNA或者任意的二级结构；所述结构②环状部位的一侧有一个稳定的二级结构，其环状部位的长度应为6-50nt，一侧的二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C...

【技术特征摘要】
1.一种制备环状RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，设计对T4RNA连接酶2具有适当反应性的线性RNA底物，采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状RNA的二级结构，ΔG值＜0，模拟结果为结构①或结构②，所述结构①中间为凸环，凸环的两侧各有一个稳定的二级结构，凸环的长度为1-50nt；中间凸环两侧的稳定二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对，其余部分为任意长度的RNA或者任意的二级结构；所述结构②环状部位的一侧有一个稳定的二级结构，其环状部位的长度应为6-50nt，一侧的二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对；ΔG值＞0，模拟结果为结构③：结构③为环状结构，其长度为12-50nt；
步骤二，设计断开位点：1)当模拟结构符合结构①时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；2)当模拟得到的结构符合结构②时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；当模拟得到的结构符合结构③时，断开位点在该环状结构中的任一位置；
步骤三，按步骤二所设计的断开位点，合成新的线性RNA作为连接成环的底物，并进行5′端磷酸化修饰；
步骤四，将步骤三得到的线性RNA、T4RNA连接酶2、连接酶缓冲液和RNA酶抑制剂混合，0-37℃下恒温反应2-12h。


2.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四成环反应中线性RNA链不存在干扰T4RNA连接酶2识别和结合的...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁兴国，陈辉，安然，程凯，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37