一种制备环状RNA的方法技术

本发明专利技术属于核酸技术领域，具体涉及一种制备环状RNA的方法，主要解决线性RNA成环过程中存在的大分子聚合副产物随着底物浓度的增加而急剧增加，目的环状RNA产率低；并需要借助夹板链或辅助链，后期处理步骤繁琐的问题。针对要连接成环的线性RNA序列，先用Mfold或RNAstructure program等软件模拟成环后的二级结构，根据环状RNA的二级结构设计断开位点；以设计好的线性RNA为原料，采用T4RNA连接酶2(T4RNA Ligase 2)直接进行连接。连接过程中无需借助夹板链或辅助链，降低了后续纯化工艺的难度；成环的过程当中大分子副产物的产生被显著抑制，从而实现了目的环状RNA的高效制备。

A method of preparing circular RNA

【技术实现步骤摘要】
一种制备环状RNA的方法
本专利技术属于核酸
，具体涉及一种制备环状RNA的方法。
技术介绍
与线性RNA(L-RNA)相比，单链环状RNA(C-RNA)因无游离末端而对核酸外切酶具有较强抗性(J.Am.Chem.Soc.,2007,129,15108–15109；J.Biotechnol.,2009,139,265-272.)。环状RNA(circRNA)几乎在所有生物界中都有存在，相关研究表明其可作为miRNA或RNA抑制剂，还可被翻译，并具有调节其他蛋白质功能等诸多作用(Nature,2013,495,333-338；Nat.Rev.Genet.,2019,20,675-691.)。也有相关研究表明，哑铃形C-RNA可使活细胞中的siRNA寿命大大延长(Chem.Sci.,2018,9,44–51；Bioorg.Med.Chem.,2013,21,6198–6204.)。通过将siRNA中的反义RNA链环化并与线性的正义链相结合，可显著降低脱靶效应(Mol.Ther.Nucl.Acids,2017,10,237-244.)。核酶(Ribozyme)和RNA适配体(Aptamer)的环化还被广泛应用于对其功能的调控当中(Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52,7004-7008；Sci.Reports,2015,5,16435.)。当L-RNA被环化后，其功能被暂时抑制(如核酶的切割活性以及siRNA与miRNA的基因沉默作用等)，当利用光照或其他外部刺激将环打开时，又可以在恰当的时间和地点释放其功能(Bioorg.Med.Chem.,2013,21,6198–6204；Chem.Sci.,2018,9,44-51；Mol.Ther.Nucl.Acids,2017,10,237-244.)。同时，C-RNA在纳米结构的构建和纳米机器的设计当中也具有相当重要的作用(Bull.Chem.Soc.Jpn.,2017,90,967-1004；Bull.Chem.Soc.Jpn.,2018,91,1075-1111.)。因此，C-RNA的人工合成具有相当大的实际应用价值。然而，目前关于C-RNA合成的信息严重匮乏，规模化制备所需序列和尺寸的C-RNA的方法尚未被建立。目前常用酶法环化L-RNA来制备C-RNA。T4RNA连接酶2(T4Rnl2，一种双链RNA连接酶)常被作为工具酶来使用(RNABiol.,2017,14,1018–1027；NucleicAcidsRes.,2015,43,2454-2465.)。而直接利用Yin等人(Virology,2004,319,141–151.)所建立的方法进行环化时，由于环化效率高度依赖于L-RNA的结构，所以制备不是很成功。因此，需要添加与L-RNA末端互补的辅助寡核苷酸(splint，下称夹板)以使两末端靠近形成“切口”(Nick)，再由Rnl2识别这个“切口”而发挥连接作用(RNA,2005,11,1909-1914.)。然而，在利用这种方法进行环化时，常伴随着分子间连接反应的发生，产生相当多的聚合副产物，尤其在高底物浓度条件下，分子间连接反应更加占据主导地位，这显著降低了C-RNA的产量，并使得实际合成以及后续的产物纯化回收过程(需用DNase等去除夹板)更加复杂化。此外，由于短链L-RNA(e.g.<30nt)和夹板形成的环化中间体在环化体系中不能稳定存在(NucleicAcidsRes.,2018,46,e132；NucleicAcidsRes.,2009,37,e19.)，因此利用上述方法难以制备得到尺寸较小的环。即便使用T4RNA连接酶1(T4Rnl1，一种单链RNA连接酶)，当底物浓度较高时，分子间连接反应仍较分子内环化更易发生(RNABiol.,2017,14,1018–1027；Sci.Reports,2015,5,16435.)。为了抑制分子间连接反应的发生，须使用专门设计的DNA辅助链(helper)，这给后续的产物纯化和回收造成了困难(RNABiol.,2017,14,1018–1027；NucleicAcidsRes.,1998,26,2502–2504.)。单链RNA环化酶(ssRNACircLigase)的环化过程需要以Mn2+作为辅因子，且要实现高效环化需要消耗大量的环化酶，成本较高(NucleicAcidsRes.,2017,45,e139；NucleicAcidsRes.,2008,36,e40；Cell,2006,127,71-84.)。因此，亟需建立一种能同时满足在高底物浓度条件下获得较高环化产率和较高产物纯度的单链RNA环化方法。
技术实现思路
针对线性RNA成环过程中存在的大分子聚合副产物随着底物浓度的增加而急剧增加，目的环状RNA产率低；并需要借助夹板链(splint)或辅助链(helper)，后期处理步骤繁琐的问题，本专利技术提供了一种环状RNA的制备方法，针对要连接成环的线性RNA序列，先用Mfold或RNAstructureprogram等软件模拟成环后的二级结构，根据环状RNA的二级结构设计断开位点；以设计好的线性RNA为原料，采用T4RNA连接酶2(T4RNALigase2)直接进行连接。连接过程中无需借助夹板链(splint)或辅助链(helper)，降低了后续纯化工艺的难度；成环的过程当中大分子副产物的产生被显著抑制，从而实现了目的环状RNA的高效制备。本专利技术采用的技术方案如下：一种制备环状RNA的方法，包括以下步骤：步骤一，设计对T4RNA连接酶2具有适当反应性的线性RNA(L-RNA)底物，采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状RNA(C-RNA)的二级结构，ΔG值＜0，模拟结果为结构①或结构②，所述结构①中间为凸环，凸环的两侧各有一个稳定的二级结构，凸环的长度为1-50nt；中间凸环两侧的稳定二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对，其余部分为任意长度的RNA或者任意的二级结构；所述结构②环状部位的一侧有一个稳定的二级结构，其环状部位的长度应为6-50nt，一侧的二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对；ΔG值＞0，模拟结果为结构③：结构③为环状结构，其长度为12-50nt；步骤二，设计断开位点：1)当模拟结构符合结构①时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；2)当模拟得到的结构符合结构②时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；当模拟得到的结构符合结构③时，断开位点在该环状结构中的任一位置；步骤三，按步骤二所设计的断开位点，重新确定线性RNA(L-RNA)底物的序列，作为连接成环的底物，合成并进行5′端磷酸化修饰；步骤四，将步骤三得到的线性RNA、T4RNA连接酶2(T4Rnl2)、连接酶缓冲液(T4Rnl2buffer)和RNA酶抑制剂(RiboLockRNaseInhibitor)混合，0-37℃下恒温反应2-12h。进一步地，所述步骤四成环反应中线性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备环状RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一，设计对T4 RNA连接酶2具有适当反应性的线性RNA底物，采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状RNA的二级结构，ΔG值＜0，模拟结果为结构①或结构②，所述结构①中间为凸环，凸环的两侧各有一个稳定的二级结构，凸环的长度为1-50nt；中间凸环两侧的稳定二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对，其余部分为任意长度的RNA或者任意的二级结构；所述结构②环状部位的一侧有一个稳定的二级结构，其环状部位的长度应为6-50nt，一侧的二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对；ΔG值＞0，模拟结果为结构③：结构③为环状结构，其长度为12-50nt；/n步骤二，设计断开位点：1)当模拟结构符合结构①时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；2)当模拟得到的结构符合结构②时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；当模拟得到的结构符合结构③时，断开位点在该环状结构中的任一位置；/n步骤三，按步骤二所设计的断开位点，合成新的线性RNA作为连接成环的底物，并进行5′端磷酸化修饰；/n步骤四，将步骤三得到的线性RNA、T4 RNA连接酶2、连接酶缓冲液和RNA酶抑制剂混合，0-37℃下恒温反应2-12h。/n...

【技术特征摘要】
1.一种制备环状RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，设计对T4RNA连接酶2具有适当反应性的线性RNA底物，采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状RNA的二级结构，ΔG值＜0，模拟结果为结构①或结构②，所述结构①中间为凸环，凸环的两侧各有一个稳定的二级结构，凸环的长度为1-50nt；中间凸环两侧的稳定二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对，其余部分为任意长度的RNA或者任意的二级结构；所述结构②环状部位的一侧有一个稳定的二级结构，其环状部位的长度应为6-50nt，一侧的二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对；ΔG值＞0，模拟结果为结构③：结构③为环状结构，其长度为12-50nt；
步骤二，设计断开位点：1)当模拟结构符合结构①时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；2)当模拟得到的结构符合结构②时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；当模拟得到的结构符合结构③时，断开位点在该环状结构中的任一位置；
步骤三，按步骤二所设计的断开位点，合成新的线性RNA作为连接成环的底物，并进行5′端磷酸化修饰；
步骤四，将步骤三得到的线性RNA、T4RNA连接酶2、连接酶缓冲液和RNA酶抑制剂混合，0-37℃下恒温反应2-12h。


2.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四成环反应中线性RNA链不存在干扰T4RNA连接酶2识别和结合的...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁兴国，陈辉，安然，程凯，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37