蒙古沙冬青诱导型启动子的克隆及应用制造技术

本发明专利技术提供了分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物受逆境的条件下和植物激素诱导表达。还提供了包含该启动子的表达盒、表达载体，及用该表达盒转化植物的方法。

Cloning and application of inducible promoter of Ilex mongolica

【技术实现步骤摘要】
蒙古沙冬青诱导型启动子的克隆及应用
本专利技术涉及植物基因工程和生物
，具体涉及一种蒙古沙冬青诱导型启动子的克隆及应用。
技术介绍
植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结果。植物基因表达调控受多种内外因子的精细调控，具有严格的时间及空间有序性，基因表达调控包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控最为关键。而启动子是转录水平调控的重要元件。所以植物自身的启动子决定了其基因的表达水平。根据启动子作用方式及功能可分为以下三类：即组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。组成型启动子是在植物所有组织中都能启动基因的表达，基因表达具有持续性。应用组成型表达的启动子能使外源基因在受体植株的所有组织中持续地表达，使外源基因表达产物发挥最大的功能。应用最广泛的是烟草花叶病毒基因CaMV35S启动子(Odell,etal.1985)、水稻肌动蛋白Actin1启动子(Mcelroy,etal.1990)及玉米泛素Ubiquitin启动子(Holtorf,etal.1995)。但由于组成型启动子驱动的目的基因在植物的所有组织中都持续地表达，导致植物体内的物质和能量过度地消耗，因此组成型启动子在植物基因工程中的应用也存在一定的缺陷。如果外源基因在植物体的各个器官中持续表达，一方面会导致植物体内产生大量的异源蛋白质或代谢产物，破坏植物体原有的代谢平衡，并进一步影响植物体的产量和品质的提高，以及形态特征的建成；另一方面，有些代谢产物对植物并不是必需的，这将会阻碍植物的生长发育，最终可能导致植物体死亡。为了克服组成型启动子给植物带来的不利影响，就必须寻找一些其他的启动子，比如诱导型启动子。诱导型启动子是当植物受到周围生物或非生物环境胁迫时，才会启动相应的功能基因表达来适应和抵御不良环境。当周围不良环境改善后，相应的功能基因表达就减少或停止。这就降低了目的基因在植物的所有组织中都持续表达给植物带来的不利影响，所以对诱导型启动子的研究和应用近年来受到越来越多科研工作者的重视。沙冬青(Ammppiptanthusmongolicus)又名蒙古沙冬青，是我国荒漠地区特有的常绿阔叶灌木，其在长期恶劣的气候条件下形成极强的抗旱、耐寒性，是研究植物抗逆机制很好的材料。因此以沙冬青为材料，克隆其脱水素基因启动子(PAmDHN)，为转基因作物抗逆育种提供理论基础。
技术实现思路
本专利技术以抗逆性极强的植物沙冬青为材料，克隆了其脱水素基因(AmDHN)的上游启动子序列，利用TSSP和PlantCare数据库分析其序列，发现该序列具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box，并且具有多个与低温、干旱、盐胁迫和植物激素诱导相关的顺式作用元件，其中包括1个DRE和3个ABRE等诱导元件。根据启动子序列构建了含有不同诱导元件的截短形式的植物表达载体，将植物表达载体转入拟南芥，获得转基因拟南芥植株。利用不同诱导因子处理转基因拟南芥植株，观察到转基因拟南芥植株中的GUS基因大量表达，所以确定了该启动子为诱导型启动子。本专利技术解决的技术问题：提供一种分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受逆境胁迫和植物激素诱导表达，所述分离的DNA的序列如SEQIDNO：1所示，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受低温胁迫、植物激素诱导表达。优先的是，植物激素为ABA或SA。含有上述启动子的表达盒、重组表达载体、工程菌或转基因，其中所述核酸能够赋予植物抗逆或诱导表达的性状。本专利技术提供一种所述的表达盒转化的转基因植物的生产方法，其包括：(1)构建包含启动子的的表达盒；(2)将步骤(1)获得的表达盒导入植物细胞；(3)再生出转基因植物；和(4)选择出转基因植物；(5)增殖步骤(4)获得的植物以获得后代。本专利技术还提供赋予植物耐逆性状或植物激素诱导表达的方法，其包括(1)选择能够赋予植物耐逆性状或植物激素诱导表达的核酸：(2)使用步骤(1)获得的核酸构建表达盒；(3)将步骤(2)获得的表达盒导入植物细胞；(4)再生出转基因植物；和(5)选择出赋予了植物耐逆性状的转基因植物；(6)增殖步骤(5)获得的植物以获得后代。本专利技术还提供一种在植物中表达异源核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物体导入特定表达盒，所述特定表达盒含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的异源核苷酸序列，其中所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，作为优选的是，其中所述的植物为蒙古沙冬青。将沙冬青脱水素基因启动子(PAmDHN)的序列扩增后，克隆至含有报告基因GUS的植物表达载体，将构建好的载体转化拟南芥，获得转基因株系，并用GUS显示底物MUG对转基因植株染色，显微镜下观测拟南芥植株组织染色情况。有益效果：本专利技术首次提供本专利技术提供一种蒙古沙冬青诱导型启动子及其应用。该启动子的特异性很强，因此为植物育种的研究提供了有效的工具。附图说明图1：蒙古沙冬青基因组DNA特异性引物的设计；图2：蒙古沙冬青PAmDHN启动子基础和调控元件；图3：蒙古沙冬青3条不同长度的启动子序列；图4：PCR鉴定转化子；图5：融合ABA元件的启动子序列表达图谱；图6：融合低温元件的启动子序列表达图谱；图7：融合SA元件的启动子序列表达图谱；图8：拟南芥蘸花法转化及筛选步骤：拟南芥野生型(Col-0)种子表面消毒点种在MS培养基中(16h光照/天培养10天)；将MS培养基中拟南芥移栽到育苗基质中；生长3周拟南芥；生长5-6周拟南芥抽薹，准备农杆菌蘸花转化；生长9-10周拟南芥，收种子(T0代种子)T0代种子在抗性培养基上筛选(箭头所示为筛选阳性植株)；图9：转基因拟南芥PCR鉴定；图10：拟南芥GUS染色分析：(A)35s-GUS拟南芥在不同处理条件下的染色结果，分别为对照，200μMSA处理48小时，4℃低温胁迫48小时，10μMABA处理48小时；(B)pSA648拟南芥株系在不同处理条件下的染色结果，分别为对照，200μMSA处理48小时；(C)pCold262拟南芥株系在不同处理条件下的染色结果，分别为对照，4℃低温胁迫48小时；(D)pABA232拟南芥株系在不同处理条件下的染色结果，分别为对照，10μMABA处理48小时；(E)不同处理条件下不同拟南芥株系GUS含量测定。具体实施方式根据以下实施例，可以更好的理解本专利技术，但以下实施例并不表示对本专利技术的任何限制。实施例1.PAmDHN启动子序列的克隆利用染色体步移方法克隆启动子序列，方法如下：1.蒙古沙冬青基因组DNA的获取，利用植物基因组提取试剂盒提取蒙古沙冬青幼叶的基因组DNA。2.特异性引物的设计，根据已知的蒙古沙冬青脱水素基因(AmDHN)序列，在ATG下游284bp、184bp和68bp处设计3条同向3′端特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受逆境胁迫和植物激素诱导表达，所述分离的DNA的序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受逆境胁迫和植物激素诱导表达，所述分离的DNA的序列如SEQIDNO：1所示。


2.权利要求1所述的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受低温胁迫、植物激素诱导表达。


3.一种表达盒，其特征是含有权利要求1-2之任一所述的DNA。


4.权利要求3所述的表达盒，还包括其可操作地连接在权利要求1-2之任一所述的DNA的下游的核酸，其中所述核酸能够赋予植物抗逆和植物激素诱导表达的性状。


5.用权利要求3所述的表达盒转化的转基因植物的生产方法，其包括：
(1)构建权利要求3或4所述的表达盒；
(2)将步骤(1)获得的表达盒导入植物细胞；
(3)再生出转基因植物；和
(4)选...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂利珍，房永雨，
申请(专利权)人：内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：内蒙;15