一种弓形虫wx2基因缺失株、构建方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种弓形虫wx2基因缺失株、构建方法及用途，运用CRISPR/Cas9技术，将弓形虫RH株的wx2基因进行敲除，成功获得具有乙胺嘧啶药物抗性的wx2基因缺失株。具体方法是通过构建CRISPR质粒pSAG1‑Cas9‑U6‑sgwx2和药物抗性片段wx2‑DHFR，利用CRISPR质粒的靶向剪切和药物抗性片段的同源重组，经药物筛选单克隆和单克隆缺失株的鉴定，成功获得弓形虫RH株的wx2基因缺失株。本发明专利技术为弓形虫生长的分子机制的研究夯实基础，为弓形虫疫苗的研制和弓形虫药物靶标分子的研究提供了理论基础。

A wx2 gene deletion strain of Toxoplasma gondii, construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种弓形虫wx2基因缺失株、构建方法及用途
本专利技术涉及一种弓形虫基因缺失株，具体涉及一种弓形虫wx2基因缺失株、构建方法及用途。属于基因工程

技术介绍
弓形虫(Toxoplasma)在生物界的分类隶属于顶复门、孢子虫纲、真球虫目、肉孢子虫科、弓形虫属。弓形虫寄生广泛，几乎可以感染所有有核细胞。弓形虫需要中间宿主和终末宿主的参与，来完成整个生活史。弓形虫是一种机会致病性原虫，传播途径主要通过粪口、生食或半生食肉类、垂直传播，全球有三分之一以上的人感染该病原体。弓形虫不仅危害人类的身体健康，也不利于动物的繁殖和畜牧业的发展。弓形虫生活史复杂，宿主十分广泛，危害严重，但目前还没有很好的药物治疗，尤其是针对慢性期包囊的治疗。人感染弓形虫病后，通常使用磺胺嘧啶类治疗，这类药物副作用较大，对胎儿也有致畸作用。此外，目前还没有药物能够杀死包囊中的缓殖子。虽然一种商品化减毒疫苗(IntervetB.V.)已在兽医行业小范围使用，以避免羊的先天性感染。但其可能的副作用和高昂的成本限制了这一商品化疫苗的推广；同时人用弓形虫疫苗的研究仍然没有成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种弓形虫wx2基因缺失株，其特征在于，是缺失wx2基因的弓形虫RH株。/n

【技术特征摘要】
1.一种弓形虫wx2基因缺失株，其特征在于，是缺失wx2基因的弓形虫RH株。


2.根据权利要求1所述的所述的一种弓形虫wx2基因缺失株，其特征在于，该缺失株具乙胺嘧啶药物抗性。


3.权利要求1所述一种弓形虫wx2基因缺失株的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)先以pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT载体为模板，核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的上游引物sgwx2-F和下游引物sgwx2-R为引物进行PCR扩增，连接，得到pSAG1::Cas9-U6::sgwx2质粒，即为CRISPR/Cas敲除质粒；
(2)再以pUPRT::DHFR-D载体为模板，核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的上游引物wx2-DHFR-F和下游引物wx2-DHFR-R为引物进行PCR扩增，即得wx2-DHFR片段；
(3)最后将步骤(1)所得CRISPR/Cas敲除质粒、步骤(2)所得wx2-DHFR片段与弓形虫RH株制成的弓形虫悬液混合，电转，培养，筛选，获得所述的一种弓形虫wx2基因缺失株。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：先利用pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT载体、核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的上游引物sgwx2-F和下游引物sgwx2-R构建PCR反应体系，进行PCR扩增，回收PCR产物，并进行sgwx2粗产物消化；接着将步骤(1)所得消化产物进行连接，使得sgwx2由线性变为环状，得到pSAG1::Cas9-U6::sgwx2质粒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴翔，马振荣，蒋若兰，严康，管洁，舒衡平，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43