【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测序文库的归一化相关申请的交叉引用本申请要求2017年9月8日提交的美国临时申请序列号62/555,782、2017年11月6日提交的美国临时申请序列号62/582,162和2018年5月14日提交的美国临时申请序列号62/671,410的权益,其全部内容各自通过引用合并在此。
本公开通常涉及基因组学和分子生物学。
技术介绍
下一代测序(NGS)技术(例如,NGS平台)可以降低DNA和/或其他核酸测序的成本,改进所获得的信息的质量,和/或改进测序过程的可扩展性。NGS技术可以促进具有高分析深度的少量到大量DNA和/或其他核酸样品的测序,这可以允许精确的靶标DNA序列和/或其他合适序列的检测和破译(deciphering)。可以同时分析不同核酸(例如,不同DNA核酸等)的混合物,这可以促进复杂混合物(例如,从包括微生物的复杂生态群落提取的DNA和/或其他核酸等)和/或来自保守序列池的稀有DNA序列变体(例如,在大型组织的少量细胞中稀有突变的生成等)的组成分析。然而,用于NGS和/或其他测序方法的测序文库的构建可以包括文库制备过程(例如,DNA操纵、扩增等),该文库制备过程可以引入各种偏差(例如,针对不同靶标、如DNA靶标,针对靶标之间的比例等)。例如,测序文库中过表示(overrepresented)的靶标分子可能导致不足表示(underrepresented)的其他靶标分子的检测减少。额外地,测序的读段数量可能不一定表示文库(例如,在同一测序运行中测序的)中或原始混合物中存在的核酸分子(例如,DNA分 ...
【技术保护点】
1.一种用于制备归一化的组合文库的方法,所述归一化的组合文库用于与靶标集合和微生物群落相关联的测序,所述方法包括:/n基于第一扩增过程、用与来自所述微生物群落的微生物相关联的至少一个样品的靶标分子,生成扩增子靶标分子集合,其中所述靶标分子对应于所述靶标集合;/n基于处理来自所述至少一个样品的总核酸集合生成微生物群落相关联片段集合,其中所述微生物群落相关联片段集合包括宏基因组相关联核酸片段集合与宏转录组相关联核酸片段集合的至少之一;/n基于第二扩增过程、用所述扩增子靶标分子集合和微生物群落相关联片段集合,生成归一化的混合物;和/n基于第三扩增过程、用所述归一化的混合物,生成包括测序就绪分子集合的所述归一化的组合文库,其中所述测序就绪分子集合与所述靶标集合和所述微生物群落相关联。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170908 US 62/555,782;20171106 US 62/582,162;20181.一种用于制备归一化的组合文库的方法,所述归一化的组合文库用于与靶标集合和微生物群落相关联的测序,所述方法包括:
基于第一扩增过程、用与来自所述微生物群落的微生物相关联的至少一个样品的靶标分子,生成扩增子靶标分子集合,其中所述靶标分子对应于所述靶标集合;
基于处理来自所述至少一个样品的总核酸集合生成微生物群落相关联片段集合,其中所述微生物群落相关联片段集合包括宏基因组相关联核酸片段集合与宏转录组相关联核酸片段集合的至少之一;
基于第二扩增过程、用所述扩增子靶标分子集合和微生物群落相关联片段集合,生成归一化的混合物;和
基于第三扩增过程、用所述归一化的混合物,生成包括测序就绪分子集合的所述归一化的组合文库,其中所述测序就绪分子集合与所述靶标集合和所述微生物群落相关联。
2.根据权利要求1所述的方法,其中生成所述归一化的混合物包括基于所述第二扩增过程,用所述扩增子靶标分子集合、所述微生物群落相关联片段集合和基于归一化的引物集合,生成所述归一化的混合物,所述基于归一化的引物集合包括外部定义序列区域,其用于退火至所述扩增子靶标分子集合和所述微生物群落相关联片段集合。
3.根据权利要求2所述的方法,其中生成所述归一化的组合文库包括,基于所述第三扩增过程、用所述归一化的混合物和基于测序的引物集合,生成所述归一化的组合文库,所述基于测序的引物集合包括与所述测序相关联的衔接子区域。
4.根据权利要求1所述的方法,其中生成所述归一化的混合物包括基于扩增子相关联测序读段与微生物群落相关联测序读段的期望比例,调整所述扩增子靶标分子集合与所述微生物群落相关联片段集合之间的浓度比例。
5.根据权利要求1所述的方法,其还包括对所述测序就绪分子集合执行额外的归一化过程,其中执行所述额外的归一化过程包括:
将磁珠稀释到期望比例;
基于结合过程、用所述磁珠和所述测序就绪分子集合,生成珠-分子复合物集合;
将所述珠-分子复合物集合附着到磁场系统的界面板;和
将所述珠-分子复合物集合从所述界面板分离。
6.根据权利要求1所述的方法,其还包括,在生成所述扩增子靶标分子集合之前,执行以下至少一项:
将微生物RNA从所述样品转变到cDNA,来促进测序用归一化的宏转录组相关联文库的制备;和
将cDNA转变成双链cDNA,来促进测序用归一化的文库的制备。
7.一种用于制备测序用归一化的扩增子文库的方法,所述方法包括:
基于第一扩增过程、用至少一个样品和扩增子生成引物集合,生成扩增子靶标分子集合,所述扩增子生成引物集合与对应于来自所述至少一个样品的靶标分子的靶标集合相关联;
基于第二扩增过程、用所述扩增子靶标分子集合和基于归一化的引物集合,生成归一化的靶标分子集合;和
基于第三扩增过程、用所述归一化的靶标分子集合和基于测序的引物集合,生成测序就绪靶标分子集合。
8.根据权利要求7所述的方法,
其中所述扩增子生成引物集合包括第一外部定义序列区域,
其中生成所述扩增子靶标分子集合包括基于所述第一扩增过程、将所述第一外部定义序列区域添加至所述靶标分子;并且
其中所述基于归一化的引物集合包括第二外部定义的序列区域,所述第二外部定义的序列区域与所述第一外部定义序列区域相关联。
9.根据权利要求8所述的方法,
其中所述扩增子生成引物集合还包括靶标相关联区域,其用于退火至所述靶标分子的靶标序列区域,并且
其中对于所述第二扩增过程,生成所述归一化的靶标分子集合包括,添加定义量的所述基于归一化的引物集合,用于在所述第一外部定义序列区域和所述第二外部定义序列区域之间退火。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述扩增子生成引物集合还包括独特分子识别符(UMI)区域,各UMI区域包括随机“N”碱基集合,其中各随机“N”碱基选自“A”碱基、“G”碱基、“T”碱基和“C”碱基中的任何一种。
11.根据权利要求9所述的方法,
其中所述扩增子生成引物集合还包括与所述测序相关联的第一衔接子区域,
其中生成所述扩增子靶标分子集合包括基于所述第一扩增过程,将所述第一衔接子区域添加到所述靶标分子,
其中所述归一化的靶标分子集合包括添加的第一衔接子区域,并且
其中所述基于测序的引物集合包括第二衔接子区域,所述第二衔接子区域用于退火至所述归一化的靶标分子集合的所述添加的第一衔接子区域。
12.根据权利要求11所述的方法,
其中所述第一扩增过程包括第一聚合酶链反应(PCR)过程,
其中所述第二扩增过程包括第二PCR过程,
其中所述第三扩增过程包括第三PCR过程,并且
其中所述基于测序的引物集合包括测序衔接子区域,以促进使用下一代测序系统的所述测序...
【专利技术属性】
技术研发人员:扎迦利·阿普特,杰西卡·里奇曼,丹尼尔·阿尔莫纳西德,爱德华多·莫拉莱斯,罗德里戈·奥蒂兹,尼古拉斯·奥登尼斯,胡安·吉梅内斯,克里斯蒂安·布拉沃,纳塔利娅·乔西亚,爱德华多·奥利瓦雷斯,路易斯·里昂,保罗·科瓦鲁比阿斯,费利佩·塞普尔维达,费利佩·梅利斯,
申请(专利权)人:普梭梅根公司,
类型:发明
国别省市:美国;US
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