本发明专利技术公开了抗MRJP2的配对单克隆抗体及其在定性或定量检测MRJP2中的应用。本发明专利技术采用细胞融合技术通过与其它蜂王浆主蛋白交叉反应检测获得MRJP2特异性融合细胞株，根据抗原表位配对检测进行配对初筛，根据配对结果、抗体表位检测和标准曲线绘制及样本测定等筛选获得良好线性关系且灵敏度高的抗MRJP2的配对单克隆抗体，在此基础构建了检测MRJP2的ELISA检测试剂盒以及胶体金免疫检测试纸，能特异性检测MRJP2，不与其它相关蛋白产生交叉反应；试剂盒的检测范围为3.125‑200ng/mL，检测灵敏度为4.529ng/mL；热稳合格；批内批间CV值均小于10%；具有方便、快速、灵敏等特点。
Matched monoclonal antibody against mrjp2 and its application in qualitative or quantitative detection of mrjp2
【技术实现步骤摘要】
配对的抗MRJP2单克隆抗体及其在定性或定量检测MRJP2中的应用
本专利技术涉及蜂王浆主蛋白2(MRJP2)单克隆抗体的制备及其应用，尤其涉及配对的MRJP2单克隆抗体的制备，本专利技术进一步涉及用所制备的配对的MRJP2单克隆抗体构建的检测MRJP2的ELISA检测试剂盒和胶体金免疫检测试纸及其在定量或定性检测MRJP2中的应用，属于MRJP2的定性和定量检测领域。
技术介绍
蜂王浆是一种具有滋补保健和延年益寿功能的天然功能性蜂产品。蜂王浆成分复杂，营养丰富，其中蛋白质含量为12.0％～15.0％。蜂王浆主蛋白(MRJPs)是蜂王浆中一类具有重要功能的家族蛋白，具有为蜜蜂幼虫和蜂王提供营养、参与决定蜜蜂级型分化及较强的抗菌活性等功能。目前已经通过多种分子生物学途径鉴定了MRJPs中的10个成员，其中蜂王浆主蛋白2(MRJP2)为一种弱碱性的糖蛋白，在蜂王浆主蛋白中的含量为16％左右。有报道显示，MRJP2可以刺激小鼠巨噬细胞释放肿瘤坏死因子，基于此提出了MRJP2抗癌应用的潜在生理价值。也有报道显示，MRJP2是蜂王浆中的主要过敏原。蜂王浆不易保存，极易变质。已有报道显示，蜂王浆的品质和其新鲜度紧密相关。因此，实现对MRJP2的定量或者定性检测，将有利于MRJP2抗癌、抑菌等应用、蜂王浆新鲜度检测等提供支持。然而，目前对MRJP2的定量或者定性检测报道极少。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，亟待需要开发对MRJP2蛋白的特异性好、灵敏度高的蜂王浆主蛋白2单克隆抗体，以实现MRJP2蛋白的高效检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供针对MRJP2蛋白的特异性好、灵敏度高的配对的MRJP2单克隆抗体；本专利技术的目的之二是将所述的MRJP2单克隆抗体应用于MRJP2蛋白的定性或定量检测；本专利技术的目的之三提供一种定量检测检测样品中MRJP2蛋白含量的ELISA试剂盒；本专利技术的目的之四提供一种定性检测样品中是否含有MRJP2蛋白的胶体金免疫检测试纸。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术将MRJP2的全序列经过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析、无序序列分析、抗原性分析、同源性分析和结构域分析，最终选定SEQIDNo.1所述氨基酸序列为抗原序列在大肠杆菌中进行表达制备抗原。本专利技术进一步将所制备的抗原纯化后免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合技术制备融合细胞；进行半固体和液体融合获得21株阳性细胞株；挑选其中的10株进行一亚，一亚检测后筛选出多株二亚，再经过三轮的亚克隆；经过与其它蜂王浆主蛋白的重组蛋白和天然蛋白交叉反应检测，去除有交叉反应的细胞株，最终获得6株MRJP2特异性融合细胞株，挑选了其中亲和力最高的3株进行后续抗体表位检测和配对实验，根据识别不同抗原表位的抗体配对检测进行下一步的配对初筛，最终根据识别不同抗原表位的抗体配对检测、标准曲线绘制及样本测定结果发现，1F21B4(以下简称为1F2)和1B73C4(以下简称为1B7)这对配对的抗体有较好的线性关系且灵敏度高，故最终确定1F2和1B7用于构建检测MRJP2的ELISA试剂盒以及胶体金免疫检测试纸。本专利技术将分泌1F2和1B7的杂交瘤细胞系分别提交提交专利认可的机构进行保藏；其中，分泌单克隆抗体1F2的杂交瘤细胞株的微生物保藏编号为：CGMCCNo.17296；分类命名为：小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2019年2月18日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。分泌单克隆抗体1B7的杂交瘤细胞株的微生物保藏编号为：CGMCCNo.17297；分类命名为：小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2019年2月19日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术进一步提供了一种采用ELISA法定量检测MRJP2的酶联免疫试剂盒，包括：抗MRJP2的一抗，生物素标记的抗MRJP2的二抗，标准品，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，浓洗涤液，底物溶液和终止液；其中，所述的一抗是抗MRJP2的单克隆抗体1F2，所述的二抗是抗MRJP4的单克隆抗体1B7；或者，所述的一抗是抗MRJP4的单克隆抗体1B7，所述的二抗是抗MRJP4的单克隆抗体1F2。本专利技术试剂盒检测MRJP2含量的工作原理或使用方法如下：用纯化的抗体包被微孔板制成固相载体，向包被抗MRJP2抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗MRJP2抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的MRJP2含量呈正相关；用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样本浓度。应用本专利技术酶联免疫试剂盒采用双抗体夹心ELISA法定量测定样本中MRJP2含量的结果表明，其检测范围为3.125-200ng/mL，检测灵敏度为4.529ng/mL。本专利技术进一步提供了一种快速定性检测MRJP2的胶体金免疫检测试纸，包括：金标垫，含有检测线和质控线的NC膜，样本垫，吸水垫和检测底板；其中，所述的NC膜含有一条检测线和一条质控线；所述的检测线由单克隆抗体1F2和1B7组成，所述的质控线由羊抗鼠IgG抗体组成。所述的金标垫以及含有检测线和质控线的NC膜可以按照胶体金免疫试剂盒的常规制备方法制备得到。作为参考，本专利技术提供一种金标垫的制备方法，包括：(1)将胶体金溶液与单克隆抗体1F2和1B7结合得到胶体金－抗体结合物原液；(2)将胶体金－抗体结合物溶液稀释后均匀加在玻璃纤维膜上，烤干，即得金标垫。本专利技术进一步对金标垫以及含有检测线和质控线的NC膜的制备方法中的各项参数进行了优化，通过优化试验发现，采用下述参数能够有效的提升检测效果：1B74μg/mL包被，检抗1F21:500稀释的条件最佳本专利技术进一步提供了一种应用本专利技术胶体金免疫检测试纸定性检测样品中是否含有MRJP2的方法，包括：(1)将样品加到试剂盒样本垫的加样孔中；(2)若样本为阳性，加样后在T区出现一条紫红色条带；若样本为阴性，则T区不会出现紫红色条带；无论样本中是否有MRJP2蛋白存在，C区都会出现一条紫红色条带。本专利技术提供的检测MRJP2的胶体金免疫检测试纸具有方便、快速、灵敏等特点，适用于现场大批量样本检测。应用本专利技术酶联免疫检测试剂盒定量测定样本中MRJP2含量的结果表明，本专利技术酶联免疫检测试剂盒的检测范围为3.125-200ng/mL，检测灵敏度为4.529ng/mL；热破坏试验表明，热稳定性4天下降均＜30％，热稳基本合格；精密度实验结果表明，批内批间CV值均小于10％；特异性实验表明，本专利技术酶联免疫检测试剂盒以及胶体金免疫检测试纸，能够特异性检测MRJP2，不与其它相关蛋白(MRJP1、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株稳定分泌抗MRJP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B7，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 17297。/n
【技术特征摘要】
1.一株稳定分泌抗MRJP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B7，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.17297。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株1B7分泌的抗MRJP2单克隆抗体。
3.与权利要求2的抗MRJP2单克隆抗体配对的单克隆抗体。
4.一株稳定分泌权利要求2所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F2，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.17296。
5.权利要求2所述的抗MRJP2单克隆抗体或权利要求3所述的与权利要求2的抗MRJP2单克隆抗体配对的单克隆抗体在定性检测样品中是否含有MRJP2或定量检测样品中MRJP2含量中的用途。
6.一种检测MRJP2含量的酶联免疫试剂盒，包括：抗MRJP2的一抗，生物素标记的抗MRJP2的二抗，标准品，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，浓洗涤液，底物溶液和终止液，其特征在于：所述的一抗是权利要求2所述的抗MRJP2单克隆抗体，所述的二抗是权利要求3所述的与权利要求2的抗MRJP2单克隆抗体配对的单克隆抗体；或者所述的一抗是权利要求3所述的与权利要求2的抗MRJP2单克隆抗体配对的单克隆抗体，所述的二抗是权利要求2所述的抗MRJP2单克隆抗体。
7.一种检测MRJP2的胶体金免疫检测试纸，包括：金标垫，含有检测线和质控线...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡菡，魏俏红，张旭凤，冯毛，孟丽峰，韩宾，房宇，马川，李建科，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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