结合活性α突触核蛋白的抗体制造技术

提供了结合α‑突触核蛋白和结合tau纤丝的单克隆抗体及其使用方法。单克隆抗体可以是杂交瘤单克隆2F11。还提供了包含单克隆抗体2F11和可接受的药学载体、佐剂、溶媒或赋形剂的组合物。还公开了在有需要的受试者中减少活性α‑突触核蛋白的方法。该方法包括向受试者施用一定量的包含2F11的组合物。单克隆抗体2F11也可用于测定生物样本中的α‑突触核蛋白或tau纤丝的水平。

Antibodies binding to active alpha synuclein

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合活性α突触核蛋白的抗体
本专利技术涉及结合α-突触核蛋白的抗体。还描述了使用抗体的方法。
技术介绍
帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病，影响全球约1000万人，其中约15％的帕金森病患者还患有路易体(DLB)痴呆。这些代表涉及α-突触核蛋白的核心病理学，该蛋白是一种与各种疾病有关的蛋白，但迄今为止，对于其在体内的主要功能仍所知甚少。这些疾病本身的特征是症状范围很广，包括主要运动症状：静止性震颤、运动迟缓、强直、姿势不稳；以及非运动症状，包括嗅觉丧失、便秘、REM行为障碍、情绪障碍和健忘。最近，α-突触核蛋白的聚合也被证明其涉及多系统萎缩(MSA)。除路易体以外，蛋白质蓄积还可导致路易体神经轴突和树突伸长和营养不良。α-突触核蛋白的蓄积和最终沉积可形成路易体的聚合体，在神经元组织中可以显示为10-20μm的包涵体。DLB中，这些形成是广泛的，从而导致与疾病相关的症状。Tau是一种微管相关蛋白，参与维持轴突转运和神经元完整性，在树突中具有生理作用。Tau蛋白在胶质细胞中也有低水平表达。在成人大脑中，通过MAPT基因的选择性剪接表达6种tau亚型。MAPT基因突变导致与病理性tau蛋白蓄积相关的遗传性疾病。tau病(taupathy)是一种神经退行性疾病，特征为异常tau蛋白在大脑中沉积。神经病理学表型包括阿尔茨海默病、皮克(Pick)病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病(argyrophilicgraindisease)、原发性年龄相关tau病(以前称为仅神经元纤维缠结性痴呆)、球状胶质tau病(Kovacs，G.G，2015，Neuropathol.App.Neurobiol.，41，3-23).阿尔茨海默病的特征是淀粉样斑块和神经元纤维缠结，tau蛋白是主要的缠结成分(Congdon，E.E.和Sigurdsson，E.M.，Nat.Rev.Neurol.，2018年6月12日在线发表，Nature.com/nrneurol)。传统意义上讲，含α突触核蛋白的路易体与帕金森病相关，含Tau的神经元纤维缠结与阿尔茨海默病和额颞叶痴呆的各种综合征相关。然而，在一系列神经退行性疾病中，α-突触核蛋白和tau病理显著重叠和共存。例如，在较高百分比(60％)的家族性和散发性阿尔茨海默病中发现了α-突触核蛋白聚合体(路易体)，而在帕金森病中观察到了tau聚合体(神经元纤维缠结，NFT)。此外，还观察到路易体和神经元纤维缠结的共定位，因为这些蛋白在体内彼此的聚合产物中发现(Li，X.，等人，2016，J.Mol.Neurosci.60：298-304)。已知α突触核蛋白可直接结合tau并诱导tau纤丝化(Benussi，L.等人，2005，Exp.CellRes.308：78-84；Li，X.等人，J.Mol.Neurosci.2016年，分子神经科学期刊60：298-304)。因此，α-突触核蛋白和tau蛋白是易于发生病理性错误折叠和聚合的蛋白。错误折叠启动同源寡聚和聚集级联，最终导致多种神经退行性疾病中聚合的α-突触核蛋白和不溶性蛋白包含物中的Tau在大脑蓄积。(Yan，X等人，2018，SeminarsCellDevel.Biol.可访问网址：doi.org/10.1016/j.semcdb.2018.05.005)。α-突触核蛋白以三种主要亚型存在，最长为140个氨基酸。虽然小囊泡内含有少量蛋白，并且可以发生胞吐作用，但是α-突触核蛋白是一种细胞质蛋白。该蛋白已在血液和脑脊液中被检测到(Borghi等人，2000；El-Agnaf等人，2006；Kasuga等人，2010)。细胞外α-突触核蛋白可能参与了疾病在脑部的扩散，并导致神经元死亡和炎症(Desplats等人，2009)。α-突触核蛋白成为具有朊病毒样特征的疾病形成实体的过程尚不清楚。α-突触核蛋白可以通过未知数量的中间体和/或从单体可溶性蛋白(无蛋白聚糖样活性)到不溶性蛋白聚糖样活性的中间体采取复杂的途径(见图1：RobertsH.L.，BrownD.R.，2015，Biomolecules5：282-305)。具有朊病毒样活性的不溶性聚合体能够募集可溶性α-突触核蛋白，并通过从包括膜和细胞质中发现的螺旋构象(Bartels等人，2011；Wang等人，2011)至β-折叠结构的过程将其转化为聚合体。然而，生成α-突触核蛋白聚合体的过程(能够募集相同蛋白的单体并促进其纤丝化)始于一组未知的低聚体形成。人类α-突触核蛋白中的12个氨基酸肽序列(残基71-82；在β-突触核蛋白中不存在)似乎是必需的，并足以使蛋白质纤丝化。这种肽对蛋白水解有抵抗性，它可能成为α-突触核蛋白纤维的核心。对应于71-82个氨基酸序列的合成肽能够在体外自聚形成纤维，并共同组装和促进组装全长度α-突触核蛋白(Giasson等人，2001)。这种多肽可可逆性形成分子间β-折叠，证实了单体和寡聚形式之间的平衡(Bédard等人，2014)。当与阴离子囊泡接触时，多肽发生构象变化，涉及不可逆的自聚合，主要特征为β-折叠形成。这反映了天然α-突触核蛋白的结构和一般性质。阴离子膜囊泡显示，仅α-突触核蛋白71至82肽迅速形成聚合体。此外，天然α-突触核蛋白在与膜(Jo等人，2000；Lee等人，2002)和多不饱和脂肪酸(Perrin等人，2001)相互作用时可发生错误折叠或构象变化，导致寡聚化。可直接将阴离子磷脂膜上的螺旋α-突触核蛋白转化为含有β-片层的纤丝(Comellas等人，2012)。生成能够募集相同蛋白质单体的α-突触核蛋白聚合体的方案(Volpicelli-Daley等人，2014)存在一个缺陷，即小瓶速度、小瓶尺寸和形状(含有α-突触核蛋白)的微小变化可能影响小瓶中形成的气泡大小，因此，用于纤丝化过程的可用表面积直接干扰界面活化步骤。US2004/0143093讲授使用特殊设备和浓度依赖性疏水界面处理与界面活化相关的问题。此外，在原生野生型α-突触核蛋白不存在的条件下，α-突触核蛋白的羧基末端突变体表现出原纤维化。(Murray等人，2003)。尚不清楚α-突触核蛋白纤丝的内在毒性程度。成熟的α-突触核蛋白纤丝以动态平衡的形式存在，由纤丝组装和拆分生成低聚体群体。在接近生理条件下可形成低聚体(大和小)的异质混合物(Cremades等人，2012)。当纤丝分解时，产物能够在单体存在的情况下形成新的纤丝。细胞培养中(Desplats等人，2009)和突触核蛋白病模型(Hansen等人，2011)中，α-突触核蛋白聚合体传输期间，体内可发生纤丝分解。朊病毒样活性可能是由低聚体种群直接引起，或由纤丝分解产生的低聚体种群引起，例如，纤丝断裂加速α-突触核蛋白纤丝化(Shvadchak等人，2015)，具有不同结构的低聚体群体抑制纤丝形成或激活纤丝形成(Horvath等人，2013)。这些结果表明低聚体人群可能在“通路上”或“通路外”，向纤丝组装转变。两种通路上的低聚体(Lashuel等人，(2002)，Kostka等人，(2008本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种沉积在ATCC PTA-124174下的单克隆抗体2F11。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170802 US 62/540,4351.一种沉积在ATCCPTA-124174下的单克隆抗体2F11。


2.一种包含权利要求1中定义的单克隆抗体2F11的组合物，其在药学上可接受的载体、佐剂、溶媒或赋形剂中。


3.一种包含权利要求1中定义的单克隆抗体2F11的疫苗，其在药学上可接受的载体、佐剂、溶媒或赋形剂中。


4.一种在有需要的受试者中减少活性α-突触核蛋白或tau纤丝形成的方法，包括向所述受试者施用一定量的权利要求2所述的组合物。


5.一种在有需要的患者中减少活性α-突触核蛋白或tau纤丝形成的方法，包括向所述受试者施用一定量的权利要求3所述的疫苗。


6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述组合物经口服、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用于所述受试者。


7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述疫苗经口服、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用于所述受试者。


8.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述施用的步骤前，测定所述受试者中的活性α-突触核蛋白或tau纤丝的水平，并且在所述施用的步骤后的一段时间之后，测定活性α-突触核蛋白或tau纤丝的第二水平。


9.根据权利要求5所述的方法，其中，在所述施用的步骤前，测定所述受试者中的活性α-突触核蛋白或tau纤丝的水平，并且在所述施用的步骤后的一段时间之后，测定活性α-突触核蛋白或tau纤丝的第二水平。


10.一种测定样品中是否存在活性寡聚α-突触核蛋白的方法，包括：
i)所述样本的一部分与对照抗体预混合，然后加入重组的活性α-突触核蛋白单体，以产生对照治疗，
ii)将所述样本的第二部分与权利要求1中定义的单克隆抗体2F11预混合，然后加入重组的活性α-突触核蛋白单体，以产生活性治疗，
iii)使用硫磺素试验测定所述对照治疗和所述活性治疗两者中的β-折叠结构形成的量，其中，与所述对照治疗相比，所述活性治疗中的硫磺素荧光下降表明所述样品中存在活性寡聚α-突触核蛋白。


11.一种测定样品中是否存在活性寡聚α-突触核蛋白或tau纤丝的方法，包括将所述样品暴露于权利要求1中定义的单克隆抗体2F11，并测定所述单克隆抗体2F11是否与所述样品中的蛋白结合，其中，结合表明存在所述活性寡聚α-突触核蛋白或tau纤丝。


12.根据权利要求11所述的方法，其中，在所述暴露的步骤前使用非变性电泳法分离所述样品，并经由Western分析使用所述单克隆抗体2F11探测所分离的蛋白，其中结合一个或多个高分子量蛋白表明所述样品中存在所述活性寡聚α-突触核蛋白或tau纤丝。


13.根据权利要求11所述的方法，其中，使用所述单克隆抗体2F11探测所述样品的斑点印迹，并且所述单克隆抗体2F11与所述样品的结合表明存在所述活性寡聚α-突触核蛋白或所述tau纤丝。


14.一种在诊断为以下的受试者中诱导免疫反应的方法：突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩、阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病或家族性阿尔茨海默病，...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿瑞尔·劳维尔，
申请(专利权)人：思瑞麦科生物科技公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA