用于延长药物半衰期的抗体、其融合蛋白和应用制造技术

本发明专利技术属于治疗性抗体药领域，具体涉及一种用于延长药物半衰期的抗体。所述抗体序列是针对人血清白蛋白的仅包含特定重链可变区的抗体。所述抗体可以与短肽分子、抗体分子、抗体片段、细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子、肿瘤标志分子等治疗性蛋白质或多肽药物在原核系统中融合表达，产物具有延长的药物半衰期和提高的生物利用率。

Antibody, fusion protein and application for prolonging drug half-life

【技术实现步骤摘要】
用于延长药物半衰期的抗体、其融合蛋白和应用
本专利技术属于治疗性抗体药领域，涉及一种用于延长药物半衰期和提高药物生物利用率的抗体及其应用。
技术介绍
大多数蛋白和多肽药物的半衰期很短，一是因为蛋白质药物会被体内的蛋白酶降解而快速清除；二是由于肾小球的过滤作用使分子量小于60kDa的药物在肾脏代谢中也易被清除。现有技术中，尝试了各种方法延长药物体内半衰期，包括对分子结构进行改造和缀合，然而各种分子设计都或多或少存在一些问题。以GLP-1(胰高血糖样素-1)分子为例，天然的GLP-1在人体血循环中可以被二肽酶Ⅳ(dipeptidylpepidiaseⅣ，DPPⅣ；CD26)迅速降解，其体内半衰期只有2-5分钟，不具备成药性。采用氨基酸突变、赖氨酸残基脂肪链修饰、PEG化等技术可以达到每天一次用药。已经上市的此类GLP-1类似物包括(1)艾塞那肽(商品名Byetta)是第一个上市的GLP-1类似物，皮下注射，初始计量一次5ug，一天两次；(2)利拉鲁肽(商品名Victoza/Saxenda)每日注射一次，每次注射0.6mg-1.8mg；(3)利司那肽(商品名Lyxumia)起始剂量为10μg，每日一次，应用14天，维持剂量：在第15天开始20μg为固定维持剂量，每日一次。上述方法中，较为常用的方法是将多肽或蛋白质药物直接与化合物PEG相连形成聚合物，然而这样会使药物的分子量变大，同时会增加药物的副作用。在此基础之上研制的二代GLP-1类似物，采用HSA或Fc蛋白融合技术，可以达到一周一次用药。例如，将多肽或蛋白质药物直接与人Fc区相连融合表达的杜拉鲁肽(商品名：)是由美国Lily公司研发的新型长效GLP-1R激动药，由两个具有DPP-4抑制作用的GLP-1类似物和人免疫球蛋白重链IgG4-Fc片段融合得到，其活性与内源性GLP-1相似，半衰期为5天，能有效延缓肾脏的清除作用。FDA于2014批准的杜拉鲁肽皮下注射液上市。每周给药一次，每次给药量0.75mg-1.5mg。然而与人Fc区融合表达的药物具有引发ADCC、CDC的风险。另一种方法是将多肽或蛋白质药物直接与化合物PEG相连形成聚合物，然而这样会使药物的分子量变大，同时会增加药物的副作用。还有一种方法是将多肽或蛋白质药物直接与人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin，HSA)相连融合表达。人血清白蛋白是人体血液中的主要蛋白，该蛋白由585个氨基酸构成，是人体循环系统内的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的浓度为34～54g/L.白蛋白是最丰富的血浆蛋白，具有高度的可溶性，非常稳定，能与人体内药物分子结合运输到体内各个部位发挥疗效。目前市场上的阿必鲁肽(Albiglutide)，是两个GLP-1分子串联后在C端连上改造后的人血清白蛋白，建议给药量30毫克，每周一次。然而与人血清白蛋白融合表达的药物分子量较大，不具有很好的细胞穿透性。尽管目前市场上已有多种延长多肽或蛋白质药物半衰期的药物，但不是用量大就是半衰期短，仍有必要进一步开发具有延长的药物半衰期，同时成本更为低廉，患者依从性更好的药物结构。
技术实现思路
本专利技术涉及一种延长治疗性蛋白质治疗效果特别是延长其半衰期的方法，特别是该方法中使用的具有特定结构的抗体，以及依照该方法所获得的包含治疗性蛋白质的融合蛋白。具体而言，本专利技术利用特定引物扩增获得的抗体cDNA而构建噬菌体库，并筛选得到了与人血清白蛋白结合的一组抗人血清白蛋白抗体，该抗体在与特定治疗性蛋白质药物融合表达后可延长药物半衰期。本专利技术的一方面涉及一种抗体，其特征在于仅包含抗人血清白蛋白抗体的重链可变区，优选由FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1、CDR2、CDR3组成。优选的，所述抗体的CDR区如表1的SEQIDNO:1-28任一序列的三个CDR区的组合所示。表1如SEQIDNO:1-28所示的抗体氨基酸序列结构优选的，所述抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1-28的任一项所示，或者与SEQIDNO:1-28的任一项具有至少70％的序列同一性，更优选的，与SEQIDNO:1-28的任一项具有至少80％的同一性，再优选的，与SEQIDNO:1-28的任一项具有至少90％的同一性，进一步优选的，与SEQIDNO:1-28的任一项具有至少95％的同一性。本专利技术的第二方面涉及一种包含治疗性蛋白质以及上述抗体的融合蛋白。可选的，所述治疗性蛋白质选自短肽分子、抗体分子、抗体片段、细胞因子，干扰素，肿瘤坏死因子，肿瘤标志分子。优选的，所述治疗性蛋白质为GLP-1或其类似物、衍生物。优选的，使用胰高血糖素样肽-1(glucagon-like-peptide1，GLP-1)，其是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素。GLP-1(7-37)的序列如SEQIDNO:70所示：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。GLP-1的类似物或衍生物是指与GLP-1具有同源性，并且具有相同生物学活性的结构类似物，包括但不限于下列药物的治疗性蛋白部分：杜拉鲁肽(Dulaglutide)、利拉鲁肽(Liraglutide)、索马鲁肽(Semaglutide)、阿比鲁泰(Albiglutide)、他司鲁泰(Taspoglutide)、Tirzepatide、利西拉来(Lixisenatide)等。本专利技术的抗体片段包括但不限于，例如单链抗体(singlechainantibodyfragment，scFv)及其多价形式，Fab和重链抗体。本专利技术的第三方面涉及包含GLP-1或其类似物、衍生物，以及由抗人血清白蛋白抗体重链可变区组成的抗体的融合蛋白。作为进一步优选的实施方案，本专利技术的融合蛋白在抗体和治疗性蛋白质之间包含连接短肽，所述连接短肽具有下述任一种结构：(1)(GX1GGS)n其中X1为G或S，n为2-7任一值，或(2)(GGGS)n，其中n＝2。作为具体的实施方式，本专利技术融合蛋白的氨基酸序列选自SEQIDNO:35-41。本专利技术的又一方面涉及一种上述抗体的筛选方法。所方法包括如下步骤：(1)以人血清白蛋白免疫羊驼(llama)；(2)分离羊驼外周血PBMC，提取mRNA，反转录成cDNA；(3)两轮PCR扩增目的片段，构建成噬菌体库，利用ELISA筛选免疫阳性克隆；(4)将阳性克隆进行诱导表达纯化，测定与人血清的亲和力；进一步的，本专利技术还涉及利用所述抗体制备融合蛋白的方法，其进一步包括以下步骤：(5)将阳性克隆序列与治疗性蛋白质序列在原核系统中融合表达、纯化。在上述制备方法中，使用特定的引物扩增目的抗体片段是关键的。本专利技术利用统一的两套引物分别进行两轮PCR扩增，实现了对目的抗体DNA序列的扩增。所述引物为：引物名称引物序列Kz-001CAGGTGAAGGTCATCGARTC(SEQIDNO:29)<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体，其特征在于仅包含抗人血清白蛋白抗体的重链可变区，并由FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1、CDR2、CDR3组成；优选的，所述抗体的CDR区如表1的SEQ ID NO:1-28任一序列的三个CDR区的组合所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗体，其特征在于仅包含抗人血清白蛋白抗体的重链可变区，并由FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1、CDR2、CDR3组成；优选的，所述抗体的CDR区如表1的SEQIDNO:1-28任一序列的三个CDR区的组合所示。


2.根据权利要求1的抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO:1-28中的任一项所示，或者与SEQIDNO:1-28的任一项具有至少70％的序列同一性，优选的，所述抗体的编码基因序列如SEQIDNO:42-69所示。


3.一种融合蛋白，包含治疗性蛋白质以及权利要求1-2任一项的抗体。


4.根据权利要求3的融合蛋白，其中，所述治疗性蛋白质选自短肽分子、抗体分子、抗体片段、细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子、肿瘤标志分子。


5.根据权利要求3的融合蛋白，其中，所述治疗性蛋白质为GLP-1或其类似物、衍生物，GLP-1优选具有如SEQIDNO:70所示的氨基酸序列。


6.一种融合蛋白，包含GLP-1或其类似物、衍生物，还包含由抗人血清白蛋白抗体重链可变区组成的抗体。


7.根据权利要求3-6中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：李福胜，庄文超，赵运星，凌志，莫春生，林兆新，
申请(专利权)人：康维众和中山生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44